◆ 编者按

食管癌是发生在食管上皮组织的恶性肿瘤，在我国的发病率较高。尽管过去几年食管癌的治疗已经有所改善，但死亡率依然很高，所以食管癌的早期诊断对于治疗来说至关重要。目前对于食管癌的早期诊断主要集中在基因水平上，但蛋白质是基因的功能执行者，因此在蛋白水平实现对食管癌的早期诊断尤为必要和重要。

2021年8月16日，Nature Communications（IF: 14.919）杂志发表了一篇题为《Large-scale and high-resolution mass spectrometry-based proteomics profiling defines molecular subtypes of esophageal cancer for therapeutic targeting》的研究成果，该研究利用大规模蛋白质组和磷酸化修饰蛋白质组学对食管癌进行了分子分型：低危S1亚型和高危S2亚型，构建了由ELOA和SCAF4组成的诊断和预后模型，同时筛选找到了治疗S2亚型食管癌的药物。该研究为改善食管癌患者的诊断和预后提供了潜在的治疗前景。

【研究材料】

124对食管癌组织和癌旁非肿瘤组织、295例病人的食管癌组织

【技术方法】

蛋白组学（TMT）、磷酸化修饰蛋白组学(label free phosphoproteomics)、免疫组化

【技术路线】

◆ 主要结果

1. 大规模蛋白组和磷酸化修饰蛋白组分析

作者使用TMT蛋白组学和label free磷酸化修饰组学分别对124对和31对食管癌组织和癌旁非肿瘤组织进行分析，鉴定和定量到的蛋白、磷酸化位点和磷酸化蛋白数量如下表所示（图1a-1d）。无监督聚类分析和分层聚类结果证明肿瘤样本能与癌旁非肿瘤样本显著分开且无批次效应（图1e和1f）。对定量蛋白和定量磷酸化蛋白进行亚细胞定位发现，绝大部分蛋白定位于细胞核、细胞膜、细胞质基质、线粒体和胞外空间（图１g）。

图1 大规模蛋白组和磷酸化修饰蛋白组分析

2. 差异蛋白分析和通路分析

根据蛋白组学和磷酸化修饰蛋白组学的结果进行差异分析，得到的显著差异蛋白和显著差异磷酸化位点的统计数量如下表所示（图2a和图2c）。对显著性差异蛋白的功能富集分析发现，一些信号通路如细胞周期、DNA修复、免疫应答、上皮间充质转变在肿瘤组织中上调，而代谢通路、雌激素响应相关的通路下调（图2e）。磷酸化修饰蛋白组学结果显示剪接体通路中的蛋白被高度磷酸化（图2f），具体结果可见图2h。

作者将蛋白组学结果与之前的基因结果比对，35个已报道的显著变化基因中的30个在蛋白组学水平被检测到（图2i），但基因水平的变化与蛋白水平的变化不完全同步。有些未在基因水平上发生变化的蛋白，在蛋白水平却发生了显著变化。蛋白组和磷酸化蛋白组的研究补充了之前基因组研究的不足，有助于从更多角度更加深刻理解食管癌的发病机制。

图2 蛋白组和磷酸化修饰蛋白组学中显著变化的蛋白和富集信号通路

3. 蛋白组学分析将食管癌分为低危S1亚型和高危S2亚型

根据蛋白组学结果中显著变化的排名前25%的蛋白在无监督聚类分析（图1e）和分层聚类（图1f）结果中的分布，作者将食管癌分为两种亚型：低危S1亚型和高危S2亚型（图3a和3b），相对于S1亚型，S2亚型的总体生存期和无病生存期都较短（图3c）。

为了进一步描述这两种亚型，作者将蛋白组学中全部样本定量到的蛋白和磷酸化修饰组学中的磷酸化位点分别做了差异分析（图3e和3f）。S2亚型（vs S1亚型）显著上调蛋白的富集信号通路（如DNA复制、mRNA加工）与肿瘤组织（vs 癌旁非肿瘤组织）上调蛋白的富集信号通路一致，意味着这些通路的变化最终导致了高危S2亚型的发生（图3d和3g）。

磷酸化修饰组学中差异蛋白富集的信号通路主要富集在剪切体、有丝分裂信号通路，这与肿瘤组织富集到的信号通路也一致，意味着这些通路的高度磷酸化对于食管癌的起始和发生发挥着非常重要的作用（图3h）。

图3 食管癌分子分型的确定

4. 食管癌中由ELOA和SCAF4组成的亚型诊断模型的确定

为了确定在临床中能用到的亚型诊断模型，作者将模型的最大数量设置为1、2、3或4进行特征选择，以ROC曲线下最大面积(AUC)为标准，最终确定出“ELOA,SCAF4”为亚型诊断模型（图4a和4b）。构建以ELOA和SCAF4为特征的SVM分类模型进行亚型预测，对124例进行蛋白质组学分析的患者，其AUC为0.976（图4d）。为进一步验证亚型诊断模型的可靠性，295例病人的食管癌组织样本进行免疫组化实验，结果显示ELOA和SCAF4在S2亚型中的染色明显高于S1亚型（图4e和4f）。Kaplan-Meier曲线和log-rank检验均显示S2亚型比S1亚型的总体生存期和无病生存期都较短（图4g和图4h）。上述结果均证实亚型诊断模型能精确的预测食管癌亚型。

图4 亚型诊断模型的确定

5. 治疗S2亚型食管癌药物的预测和验证

为找到能治疗食管癌病人的药物，作者首先用肿瘤组织/肺肿瘤组织中显著差异表达的蛋白与Connectivity Map数据库中的结果进行比对，筛选到五种药物。同时为找到更适合S2亚型食管癌治疗的药物，作者选择在S1和S2亚型中均差异表达的蛋白且与总体生存期显著相关的蛋白与Connectivity Map数据库中的结果比对，初筛到六种药物(图5a)。将六种药物在六种食管癌细胞上进行验证，发现这六种药物在六种癌细胞中均发挥了抑制其增殖的作用，且以G28510、Menadione和Sulconazole的作用尤为明显（图5c）。克隆形成实验（图5d）和动物实验（图5e-5h）也证明了三种药物的有效性。

为验证这三种药物对细胞增殖的影响是否与它们对S1和S2亚型差异表达蛋白的调控有关，作者使用蛋白组学的方法进行了验证，结果显示三种药物均在S1、S2亚型中差异表达的蛋白上发挥了调控作用（图6a-6b）。综上所述，G28510、Menadione和Sulconazole这三种药物可用于S2亚型食管癌病人的治疗。

图5 药物的预测和验证

图6 药物对S1、S2亚型差异表达蛋白的调控

肿瘤的分子分型即通过NGS、蛋白质组等组学技术，对肿瘤进行分子谱的系统描绘，并根据分子特征谱，进行肿瘤的精准分类及精准诊疗研究。现在分子分型已成为国家精准医疗战略的重点研究投入方向，目前也备受CNS顶刊杂志青睐。

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