胆囊切除术后的腹泻 (PCD) 是胆囊切除术后非常常见的并发症，其发生率高达 57.2%。现如今由于胆囊结石患病率的增加，以及胆囊切除术作为胆结石患者治疗方案，使得PCD在全球范围内影响着大量人群的健康问题。目前对于PCD发病机制的深刻理解和有效的治疗方案仍不清晰。现有研究发现PCD患者肠道菌群存在差异，并且胆囊切除术对肠道菌群的影响也有相关报道。然而，PCD患者肠道菌群的改变仅是腹泻本身的结果还是PCD发生的促成因素仍没有定论。此外，肠道菌群变化如何以及在多大程度上导致PCD仍待解开。
2023年2月，来自复旦大学附属闵行医院张紫平教授团队和王立顺研究员团队在Gut Microbes（IF 9.434）上共同发表题为“Gut microbiota alteration after cholecystectomy contributes to post-cholecystectomy diarrhea via bile acids stimulating colonic serotonin”的文章。该研究通过粪菌移植胆囊切除术后腹泻 （PCD）患者肠道菌群，确定菌群对腹泻的影响。随后通过菌群结构功能分析揭示了色氨酸代谢途径中血清素的重要作用，结合代谢组学发现菌群产生的次级胆汁酸可在体内外刺激血清素产生，并通过TGR5 / TRPA1信号通路介导，最终建立肠道菌群-粪便BAs代谢物-TGR5/TRPA1-血清素轴并明确其在PCD过程中的关键作用机制。中科新生命提供了靶向色氨酸代谢组学检测服务。
研究材料
粪便、血清、结肠组织、细胞系
临床样本：胆囊切除术后腹泻（PCD）患者（n=10），非PCD患者（n=5），健康对照组（HC，n=5）；动物模型：抗生素处理的无菌鼠；细胞模型：大鼠胰岛肿瘤细胞系RIN14B
技术路线
步骤1：16S rRNA测序揭示肠道菌群及其影响的代谢过程在胆囊切除术后腹泻（PCD）发生中的关键作用；步骤2：靶向代谢组揭示PCD小鼠结肠中血清素的生物合成是其产生不良表型的关键因素；
步骤3：PCD肠道菌群通过影响血清素的生物合成及其受体5-HTRs驱动肠道过度蠕动；
步骤4：靶向代谢组再次揭示肠道菌群来源的次级胆汁酸可以刺激血清素的产生；
步骤5：阻断BAs偶联的TGR5/TRPA1受体信号通路可以显著减轻PCD。
研究结果
1. 16S测序揭示肠道菌群及其影响的代谢过程在胆囊切除术后腹泻（PCD）发生中的关键作用研究团队选择了20例临床粪便样本进行16S rRNA测序，其中包括胆囊切除术后腹泻（PCD）患者（n=10），非PCD患者（n=5），以及健康对照组（HC，n=5）。α-多样性分析显示，与 HC 和 NonPCD 患者相比，PCD患者的菌群丰度及菌群多样性显著降低，PCoA以及NMDS也展示了不同样本组别之间微生物分布与结构的差异。接下来通过粪菌移植实验构建了基于微生物组的人源化小鼠模型，证实了PCD患者肠道菌群的改变导致了腹泻的发生，并明确了结肠作为其发生相关生理过程的主要场所。
图1 无菌小鼠在移植PCD肠道菌群后表现出腹泻表型
为了进一步探索微生物组的功能，作者对人源化模型鼠结肠腔内容物中的菌群进行了着重分析。结果显示，与NonPCD 和 HC 小鼠相比，PCD小鼠拥有最少的OUT，并且微生物多样性同样显著降低，菌群结构产生了巨大的变化。此外作者也通过PICRUSt 和 Tax4Fun两款微生物宏基因功能预测工具，分析出色氨酸代谢途径的变化可能是PCD小鼠发生腹泻的潜在影响因素。
图2 色氨酸代谢在PCD小鼠结肠内容物的宏基因组功能预测中显著富集
2. 靶向代谢组揭示PCD小鼠结肠中血清素的生物合成是其产生不良表型的关键因素
由于血清素（5-羟色胺）是色氨酸的基本代谢物，通常参与刺激肠道蠕动的调节。所以作者首先通过靶向代谢组学技术量化了其在三组小鼠结肠和血清中的表达水平。结果显示，与 HC 和 NonPCD 相比，PCD小鼠结肠和血清中的血清素水平大约升高一倍，并且与肠胃道传输时间呈负相关。为了明确血清素的来源，作者也通过免疫组化等实验确认血清素水平的升高并非来源于肠道嗜铬细胞（血清素的主要合成细胞）的过度增殖，而是可能源于其在PCD小鼠结肠中的过量产生。后续的分子实验也进一步证明了上皮细胞中血清素受体 5-HT3R 和 5-HT4R过度表达介导的结肠血清素升高，可能是加速PCD小鼠结肠蠕动的关键驱动因素。
图3 PCD肠道菌群导致小鼠结肠中血清素水平升高和其受体5-HTRs的过度表达
3. PCD 肠道菌群通过影响血清素的生物合成及其受体5-HTRs驱动肠道过度蠕动
为了进一步证实血清素及其受体5-HTRs是PCD小鼠肠道加速蠕动的关键因素，作者进行了相关验证实验。结果显示，使用色氨酸羟化酶1抑制剂降低结肠中血清素的水平，以及通过血清素受体选择性拮抗剂阻断其与血清素的结合，可以显著改善PCD小鼠腹泻表型。这些结果证实了累积的血清素对结肠过度蠕动的影响，并证明了血清素受体5-HTRs的特异性阻断对 PCD 小鼠的治疗作用。
图4 抑制血清素的合成和选择性阻断血清素受体5-HTRs可显着改善PCD小鼠的腹泻表型
为了确定肠道菌群对血清素合成的具体影响，作者在细胞层面进行了验证实验。分别将清洗过的肠道菌群与过滤掉菌群后的粪便溶液粪与RIN14B 细胞系共同孵育，结果显示肠道菌群的代谢物是影响血清素合成的关键因素。
图5 PCD患者及其人源小鼠的微生物代谢物刺激了RIN14B细胞系中的血清素生物合成
4. 靶向代谢组再次揭示肠道菌群来源的次级胆汁酸可以刺激血清素的产生
之前的研究中作者已经证实了肠道菌群紊乱导致的次级胆汁酸（BAs）代谢改变是PCD的关键原因，但是BAs 代谢产物的变化是否通过血清素导致PCD仍然未知。接下来作者通过靶向代谢组分析发现PCD小鼠粪便中的BAs代谢产物表达差异显著，并在RIN14B细胞系以及模型鼠中进一步确认这些显著变化的次级BAs对血清素合成的影响，最终体内实验和体外试验均证实了微生物来源的次级BAs可以刺激血清素的产生。
为了进一步证实次级BAs诱导 PCD 患者血清素的过量产生，作者分析了粪便胆汁酸代谢和色氨酸代谢。结果显示与 HC 和非 PCD 相比，PCD 患者粪便中BAs代谢物的表达具有显著差异，并且KEGG通路富集分析也显示色胺代谢途径在 PCD 患者的粪便中明显富集。进一步结合16sRNA测序分析结果，发现次级BAs的积累可能是由于PCD肠道菌群中过多的BAs代谢菌引起的，如梭状芽孢杆菌以及为鉴定的Lachnospiraceae。
图6 微生物来源的次级胆汁酸诱导血清素的过量产生
5. 阻断BAs偶联的TGR5/TRPA1受体信号通路可以显著减轻PCD
部分次级胆汁酸，如DCA、LCA和HDCA被发现是G蛋白偶联胆汁酸受体1 (GPBAR1) 或 TGR5的特异性激动剂，瞬时受体电位锚蛋白1 (TRPA1) 可使肠嗜铬细胞在TGR5激活后分泌血清素以调节肠胃运动。因此，作者为了验证菌群BAs代谢产物在PCD中的腹泻诱导作用，通过SBI-115和HC-030031两种选择性阻断剂阻断了这两种受体，通过免疫荧光实验结合腹泻相关表型实验，证实了微生物来源的次级BAs在PCD中过度促进肠道蠕动的作用，并提示了TGR5 拮抗剂和 TRPA1 抑制剂对 PCD 的潜在治疗功效。
图7 PCD肠道菌群通过TGR5/TRPA1信号通路诱发腹泻
文章小结
该研究证实了肠道菌群的改变影响PCD发生的因果关系，并揭示了该过程中的肠道菌群-粪便BAs代谢物-TGR5/TRPA1-血清素轴。因此减少肠道血清素的产生或阻断血清素受体可能是治疗PCD的新方式。此外阻断BAs偶联的TGR5/TRPA1受体信号通路可以显著减轻PCD，提示了TGR5拮抗剂和 TRPA1抑制剂对 PCD的潜在治疗功效。