教你成为平淡无奇的WB小能手—凝胶制备篇

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2021/2/26 9:18:00
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    WB实验流程




    样本采集保存,蛋白提取相关知识,请查看

    蛋白定量和蛋白变性相关知识,请查看



    现在正式进入跑胶环节,这一次,让小编带您总结一下制胶相关的知识点:

    SDS-凝胶电泳系统采用的是不连续性系统,上层为浓缩胶(或积层胶),下层为分离胶,先配制分离胶,浓缩胶pH 6.8,可以通过甘氨酸和和氯离子之间形成的电压对蛋白样品产生压缩,从而使蛋白样品压成一条狭窄的条带,处于同一条线上;分离胶pH 8.8,与甘氨酸的pka接近,从而使不同分子量的蛋白产生不同的泳动速度,从而使不同分子量的蛋白分开。

    分离胶浓度参考:


    (1)分离胶配制

    确定凝胶浓度后,用5mL移液器按照配方依次加入所需试剂于配胶专用烧杯中,若配置凝胶体积较少(少于15mL),加完所需试剂后,需要吹打胶溶液10次混匀。注:吹打过程中,速度不能过快,每组吸液放液时间在3s左右;每次放液不要全部放完,防止产生气泡。


    (2)灌胶

    凝胶溶液混匀后,将枪头置于凹玻璃板中间位置让胶溶液沿平玻璃板壁缓缓注入凹玻璃板与平玻璃板之间的胶室,注意控制速度,防止产生气泡。如有气泡产生,用200μL移液器将气泡吸出。

    (3)压胶(液封)

    灌胶完成后立即吸取1ml无水乙醇或纯水,沿平玻璃板壁缓缓注入凹玻璃板与平玻璃板之间的胶室。

    (4)凝胶

    在室温凝胶,时间30min。凝胶过程中,不可晃动胶板,否则会造成分离胶液面不平。

    (5)除压胶液

    确定胶凝固之后将无水乙醇倒入废液缸(然后用吸水纸将制胶器表面残留的无水乙醇擦拭干净。再用一小截滤纸伸入两块板的胶室,吸去多余的无水乙醇,直至看不见有明显的残留,禁止滤纸触碰到胶表面。

    (6)浓缩胶配制

    按照配方加入所需试剂于配胶专用烧杯中,吹打混匀。吹打过程中,速度不能过快,防止气泡产生。


    (7)灌胶

    凝胶溶液混匀后,立即移液器吸取凝胶溶液,将枪头置于凹玻璃板中间位置,将胶溶液沿着平玻璃板壁缓缓注入凹玻璃板与平玻璃板之间的胶室,注意防止产生气泡。如有气泡产生,用200μL移液器将气泡吸出。

    (8)插样品梳

    灌胶后立即将样品梳缓慢的插入两块玻璃板当中,采用梳子一端从玻璃板的一边角落斜向下插入,然后向前、向下推进的方式插入凝胶中,使梳齿完全插入凝胶中,插入的样品梳应与平玻璃板保持水平状态,不可倾斜。

    (9)凝胶

    凝胶时间为20min。20分钟后,确定浓缩胶已凝固,用双手的食指与拇指捏住梳子,平行往上拔出梳子,查看浓缩胶的梳齿是否整齐,将歪斜的胶齿用注射器针头拨齐。


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