siRNA转染使用说明

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2021/1/14
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     使用说明:

    1. siRNA转染:
    a. 细胞培养(以六孔板为例,其它培养板或培养皿可参考六孔板):在转染前一天(18-24小时)按照每孔约20-70万细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)接种到六孔板内进行培养,使第二天细胞密度能达到约70-80%。
    b. 在进行下述转染步骤前,把培养有细胞的六孔板每孔换成2ml新鲜培养液(含有血清和抗生素的完全培养液)。对于LipoRNAi™转染试剂,抗生素的存在不会影响转染效率,也不会在细胞转染后导致细胞毒性。
    c. 参考下表,取一个洁净无菌离心管,对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞,加入125µl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM® Medium,加入100pmol siRNA,并用枪轻轻吹打混匀;再加入4µl LipoRNAi™转染试剂,用枪轻轻吹打混匀,请特别注意不可vortex或离心。配制完成后,室温存放6小时内稳定。

      96-well 48-well 24-well 12-well 6-well 6cm dish 10cm dish
    无血清培养液或Opti-MEM® Medium 5μl 12.5μl 25μl 50μl 125μl 250μl 750μl
    siRNA 4pmol 10pmol 20pmol 40pmol 100pmol 200pmol 600pmol
    LipoRNAi™转染试剂 0.16μl 0.4μl 0.8μl 1.6μl 4μl 8μl 24μl
    加入siRNA后轻轻混匀,加入LipoRNAi™转染试剂后轻轻混匀,室温孵育20min (参考图3,时间不能少于20min)。
    每孔加入的混合物的量 5μl 12.5μl 25μl 50μl 125μl 250μl 750μl
    按照上述用量每孔均匀滴加LipoRNAi™转染试剂和siRNA的混合物,直接继续培养,后续无需在数小时后更换培养液

          注1:对于六孔板中一个孔的细胞,LipoRNAi™转染试剂的用量可以在2-6μl范围内进行适当调节(如果发现有细胞毒性,可以把LipoRNAi™转染试剂的用量在2-4μl范围内进行适当调节),siRNA用量可以在50-250pmol的范围内进行适当调节。通常siRNA用量(pmol)和LipoRNAi™ (μl)的用量比例为25:1,如有必要可以在10:1-40:1的范围内优化转染效果,上表推荐的比例为25:1,此时LipoRNAi™的用量相对较少,既经济又高效。最佳的转染条件,不同的细胞类型和培养条件有所不同,可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。
          注2:siRNA的推荐浓度为20µM,常用的浓度范围为10-50µM。
          注3:对于多个孔转染相同数量相同小RNA的情况可以把每个孔所需的LipoRNAi™转染试剂和siRNA按照相应倍数加大用量,然后一起混合在同一个离心管内,后续混匀后,可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。
          注4:对于其它培养板或培养器皿,各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。

          图3. LipoRNAi™转染试剂与siRNA不同孵育时间对于靶基因下调效果的影响。LipoRNAi™转染试剂与STIM1-siRNA孵育图中所示的时间后转染Hela细胞,48h后收集细胞通过Western blot检测STIM1蛋白的下调效果。Western blot所使用的STIM1抗体(AF2614 Stromal interaction molecule 1 Rabbit Monoclonal Antibody)按照说明书1:1000稀释,二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L) (A0208) 1:1000稀释。GAPDH为内参。
    d. 无论是贴壁细胞还是悬浮细胞,按照六孔板每孔125µl LipoRNAi™转染试剂-siRNA混合物的用量,均匀滴加到整个孔内,随后轻轻混匀。
    e. 继续培养约2天左右后,即可用适当方式检测siRNA对于靶基因的下调效果,例如qPCR、Western、ELISA、报告基因等。

    常见问题:
    1. 转染效率低:
    a. 优化小核酸与LipoRNAi™转染试剂比例,对于难转染的细胞,可适当增加LipoRNAi™转染试剂的用量。
    b. 应使用高纯度、无菌、无污染物的siRNA等小核酸进行转染。
    c. 贴壁细胞转染时状态良好,细胞密度达70-80%时才可进行转染,过稀或过密都可能影响转染效率,不同细胞的最佳转染密度需要自行摸索。悬浮细胞宜在对数生长期进行转染。
    d. 需使用无抗生素和无血清培养液配制LipoRNAi™转染试剂和siRNA等小RNA的混合物。
    e. 转染后培养时间不足,而被误以为转染效率偏低。不同细胞转染后至显著表达所需要培养的时间通常为约48小时。
    f. 检查细胞是否有支原体感染,支原体感染会影响细胞增殖,并很可能影响转染效率。
    g. 使用传代次数相对较少的细胞,细胞传代次数太多,对转染效率会有一定的影响。
    h. 如果没有检测到目的蛋白表达水平的变化,应该仔细核对转染用的小RNA等,确保测序结果和读码框完全正确。
    i. 如果靶基因的敲减(knockdown)效果欠佳,应该考虑尝试设计不同的siRNA。
    2. 出现一定程度的细胞毒性:
    a. 转染前,细胞至少铺板18-24小时。
    b. 减少siRNA用量,按照比例减少LipoRNAi™转染试剂。
    c. 检查是否转染时细胞密度太低。
    d. 检查细胞是否有支原体等微生物污染。
    e. 在细胞培养4-6小时之后进行换液。

    附录:
    常用多孔板和培养皿的尺寸、培养面积、细胞培养量和推荐的培养体积等相关数据表:

    Multiple Well Plates or Dishes Single Well Only for Plates
    Diameter (Bottom, mm)* Growth Area (cm2)* Average Cell Yield Total Well Volume (ml) Working Volume (ml) Recommended Volume (ml)
    6 well 34.8 9.5 9.5 × 105 16.8 1.9-2.9 2
    12 well 22.1 3.8 3.8 × 105 6.9 0.76-1.14 1
    24 well 15.6 1.9 1.9 × 105 3.4 0.38-0.57 0.5
    48 well 11.0 0.95 9.5 × 104 1.6 0.19-0.285 0.25
    96 well 6.4 0.32 3.2 × 104 0.36 0.10-0.20 0.1
    384 well 2.7 0.056 5.6 × 103 0.112 0.025-0.050 0.030
    1536 well 1.63 × 1.63** 0.025 2.5 × 103 0.0125 0.005-0.010 0.010
    3.5 cm dish 34 9 9.0 × 105 NA 1.8-2.7 2
    6 cm dish 52 21 2.1 × 106 NA 4.2-6.3 5
    10 cm dish 8.4 55 5.5 × 106 NA 11-16.5 12
    15cm dish 14 152 1.5 × 107 NA 30.4-45.6 35
    24.5cm dish 22.4 × 22.4** 500 5.0 × 107 NA 100-150 120

      *Diameter and growth area may vary depending on the manufacturer, and the listed sizes are from Corning.
      **These wells or dishes are square.