细胞增殖检测

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2020/12/4
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     1.需要用户自己准备的耗材和试剂a.PBS C0221A,或PBS (pH7.2-7.6)。
    b.固定液(免疫染色固定液P0098,或4%的多聚甲醛P0099)。
    c.洗涤液(免疫染色封闭液P0102QuickBlock™免疫染色封闭液P0260,或含3% BSA的PBS)。
    d.通透液(免疫染色强力通透液P0097免疫染色洗涤液P0106,或含0.3% Triton X-100的PBS)。
    e.去离子水或超纯水。
    f.根据实验要求:18×18mm盖玻片,6孔板或其它多孔板,或流式细胞分析仪用管子(如12×75mm)。
    2.检测体系的准备
    a.如下以6孔板或常规切片检测体系为例,如果使用12孔板、96孔板或384孔板等孔板,检测体系可以相应按比例缩小。
    b.如果检测的是悬浮细胞,请按常规的悬浮细胞的操作方式进行。例如和贴壁细胞相比,相关步骤需要增加离心步骤等,如1000×g室温离心5min。
    3.培养细胞的EdU标记及固定、洗涤和通透
    a.在6孔板中(如有必要可以加入盖玻片)培养适当数量的细胞。细胞培养过夜并且恢复到正常状态后,进行所需的药物处理或者其它刺激处理等。
    b.配制2X的EdU工作液:由于EdU工作液是与培养液等体积加入到孔板中,所以需要配制成2X的工作液。推荐的EdU终浓度为10μM (1X),用细胞培养液1:500稀释EdU (10mM)即可得到2X的EdU工作液(20μM)。
    注意:对于A549、HeLa和NIH/3T3等贴壁细胞,推荐EdU的使用终浓度为10μM。但细胞类型、培养液种类、细胞密度、细胞增殖速度等多方面的因素会影响EdU掺入到细胞中的量,因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索。如果之前使用过BrdU进行实验,则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。
    c.将37℃预热的2X的EdU工作液(20μM),等体积加入6孔板中,使6孔板中的EdU终浓度变为1X。例如设计终浓度为10μM,原先6孔板中的培养基为1ml,则将1ml 2X的EdU工作液(20μM)加入到孔板中。如果培养基体积过大,可以先吸除适量的培养液,再加入等体积的2X的EdU工作液;或者可以减少工作液的体积并增加EdU的浓度,使最终培养液中的EdU浓度为10μM,例如2ml培养液中加入220微升0.1mM EdU。更换所有的培养液可能会对细胞的增殖有影响,因此不建议替换所有的培养液。
    d.继续孵育细胞2小时。该孵育时间的长短取决于细胞生长速率,通常宜继续孵育细胞周期10%左右的时间。对于常见的哺乳动物细胞如HeLa、3T3、HEK293等,细胞周期大约在18-25小时,孵育时间宜在2小时左右。人胚胎细胞的细胞周期约30分钟,推荐的孵育时间为5分钟;酵母细胞的细胞周期约3小时,推荐的孵育时间为20分钟,增殖的神经细胞其细胞周期约5天,推荐的孵育时间为1天。孵育时间小于45分钟时,建议提高EdU的浓度;孵育时间大于20小时时,建议适当降低EdU的浓度。
    e.EdU标记细胞完成后,去除培养液,并加入1ml固定液(可以使用免疫染色固定液P0098,或4%的多聚甲醛P0099),室温固定15分钟。注:对于流式细胞仪检测,贴壁细胞胰酶消化后用培养液重悬后再固定。
    f.去除固定液,每孔用1ml洗涤液洗涤细胞3次,每次3-5分钟。
    g.去除洗涤液,每孔用1ml通透液(可以使用免疫染色强力通透液P0097免疫染色洗涤液P0106,或含0.3% Triton X-100的PBS),室温孵育10-15分钟。
    h.去除通透液,每孔用1ml洗涤液洗涤细胞1-2次,每次3-5分钟。
    i.转步骤5。
    4.动物体内EdU的标记及切片样品的处理
    EdU可以通过注射或进食等适当方式进行动物的体内标记。如下以小鼠为例,其它动物体内EdU的标记请参考相关文献。
    a.对于小鼠,可以按照10-200mg/kg的用量,把EdU用PBS配制成一定浓度,腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中。具体用量跟所用动物的种类、体重和使用方式有关,可以参考相关文献,因此初次使用时建议对EdU的使用浓度进行一定的摸索,或者直接使用50mg/kg的浓度进行测试。如果之前使用过BrdU进行实验,则可以参考BrdU的终浓度作为EdU的终浓度。EdU可以单独购买ST067
    b.4小时后或根据特定实验确定的适当时间后,快速处死小鼠,取出所需的组织,按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。EdU标记的时间也可以参考相关文献自行调整。
    c.对于冰冻切片:
    (a)加入适量固定液(可以使用免疫染色固定液P0098,或4%的多聚甲醛P0099),室温固定15分钟。
    (b)去除固定液,用适量洗涤液洗涤3次,每次3-5分钟。
    (c)去除洗涤液,用适量通透液(可以使用免疫染色强力通透液P0097免疫染色洗涤液P0106,或含0.3% Triton X-100的PBS),室温孵育10-15分钟。
    (d)去除通透液,用适量洗涤液洗涤1-2次,每次3-5分钟。
    (e)抗原修复(选做):如果同时需要进行目的蛋白的免疫荧光染色,并有必要进行抗原修复,可以使用适当的抗原修复液,例如P0090冰冻切片快速抗原修复液(5X),或者自行配制的适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
    (f)转步骤5。
    d.对于石蜡切片:
    (a)脱蜡:二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯,再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟,换新的无水乙醇3分钟。95%乙醇3分钟。85%乙醇3分钟。75%乙醇3分钟。50%乙醇3分钟。PBS 5分钟。
    (b)抗原修复(选做):如果同时需要进行目的蛋白的免疫组化染色,可以使用适当的抗原修复液,例如P0081柠檬酸钠抗原修复液(50X)P0083改进型柠檬酸钠抗原修复液(50X)P0085 EDTA抗原修复液(50X)P0086柠檬酸钠-EDTA抗原修复液(40X)P0088通用型强力抗原修复液(10X)P0092漂片抗原修复液(10X),或者自行配制适当的抗原修复液进行抗原修复处理。
    特别注意:如果使用蛋白酶K或胰酶进行抗原修复,必须反复洗涤干净,否则残留的酶会严重干扰后续标记反应。
    (c)转步骤5。
    5.EdU检测
    注意:本步骤六孔板中每孔的反应体系为500μl的反应混合物。对于12、24、48、96和384孔板,每孔的反应的体系分别为200μl、100μl、70μl、50μl和20μl的反应混合物。对于较小的孔,单位培养面积的液体用量已经适当增加,以有效避免液体蒸发可能带来的负面影响。对于切片,可以根据切片大小,每个切片使用100-200μl的反应混合物。如下以六孔板中的细胞样品为例说明具体的操作方法,对于其它孔板或切片,仅每步溶液的用量按比例调整即可,其余方法相同。
    a.配制Click Additive Solution:对于C0071S,用1.3ml去离子水溶解一管Click Additive,混匀至全部溶解,即为Click Additive Solution;对于C0071L,加入10.4ml去离子水溶解试剂盒中提供的一瓶Click Additive,混匀至全部溶解,即为Click Additive Solution。配制后可以适当分装,并-20℃保存。
    b.参考下表配制Click反应液。注意:请严格按照下表中组分顺序和体积配制Click反应液,否则点击反应可能无法有效进行;同时,Click反应液须在配制后15分钟内使用。

    组分 6孔板样品数
    1 2 4 5 10 25 50
    Click Reaction Buffer 430μl 860μl 1.72ml 2.15ml 4.3ml 10.75ml 21.5ml
    CuSO4 20μl 40μl 80μl 100μl 200μl 500μl 1ml
    Azide 488 1μl 2μl 4μl 5μl 10μl 25μl 50μl
    Click Additive Solution 50μl 100μl 200μl 250μl 500μl 1.25ml 2.5ml
    总体积 500μl 1ml 2ml 2.5ml 5ml 12.5ml 25ml

    c.去除上一步骤中的洗涤液。
    d.每孔加入0.5ml Click反应液,轻轻摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖样品。
    e.室温避光孵育30分钟。
    f.吸除Click反应液,用洗涤液洗涤3次,每次3-5分钟。
    g.如果需要对细胞核进行染色,可以参照步骤6进行。如无其它的特殊需要,即可在荧光显微镜下观察,或者使用流式细胞仪、多功能酶标仪进行荧光检测,或者用高内涵筛选仪器(一般高内涵筛选需要使用染料对细胞核进行染色)进行检测。Azide 488的最大激发波长是495nm,最大发射波长是519nm。
    6.细胞核染色
    为了检测细胞增殖的比例,可以考虑使用Hoechst 33342进行细胞核染色。一般高内涵筛选仪器也需要对细胞核进行染色。
    a.1X Hoechst 33342溶液的配制:按1:1000比例用PBS稀释Hoechst 33342 (1000X)。
    b.接上述步骤5g,吸除洗涤液后,每孔加1X Hoechst 33342溶液1ml,室温避光孵育10分钟。
    c.吸除1X Hoechst 33342溶液。
    d.用洗涤液洗涤3次,每次3-5分钟。
    e.随后即可进行荧光检测。Hoechst 33342为蓝色荧光,最大激发波长为346nm,最大发射波长为460nm。
    7.流式细胞仪检测
    对于经步骤5或6获得的细胞悬液样品进行流式检测。如果使用传统的流体动力学聚焦的流式细胞仪来测量总DNA含量,请在检测过程中使用低流速,实验中的每个样品应使用相同的收集速率和细胞浓度。EdU标记产生的荧光信号一般使用对数刻度的横坐标(如图4中的横坐标)。Azide 488的最大激发波长是495nm,最大发射波长是519nm。
    注1:建议使用未经EdU标记的细胞样品作为流式细胞仪检测的阴性对照,并选择合适的电压。
    注2:由于流式细胞仪检测比较灵敏,可根据细胞类型和实际染**况对Azide 488的使用量进行适当调整。