细胞活力检测

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2020/12/4
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     1.细胞的准备:
    使用适合进行化学发光检测的96孔板,每孔接种100μl细胞(如使用384孔板,每孔接种25μl细胞,具体用量视不同类型的384孔板而定),并确保检测时每孔的细胞数量在5万个以内(如使用384孔板宜控制在1万个以内),同时设置不含细胞的培养液孔作为阴性对照,按照细胞培养的常规方法培养细胞。如有需要,可加入药物处理细胞。此外,如有必要,也可以设置细胞的浓度梯度,以便后续确定试剂盒的使用效果。
    2.ATP标准曲线的设置(选做):
    把自备的ATP标准溶液用PBS或细胞培养液稀释成适当的浓度梯度。初次检测可以设置0、10、30、100、300、1000、3000、10,000nM这几个浓度,96孔板每孔加入100μl 的标准品。如有必要,在后续的实验中可以根据细胞中的ATP含量对标准品的浓度范围进行适当调整。如果用细胞培养液来稀释ATP标准品,稀释后需立即进行后续的发光检测,否则培养液中的ATPase等可以消耗ATP的酶会导致ATP含量下降。
    3.检测试剂的准备:
    a.融解冻存的CellTiter-Lumi™ Steady Plus发光法检测试剂,如有必要可适当分装该试剂。经测试反复冻融5次对其检测效果无显著影响。
    b.按照96孔板每孔100μl (384孔板每孔25μl)的量,取适量CellTiter-Lumi™ Steady Plus发光法检测试剂,平衡至室温。
    4.细胞活力检测:
    a.取出细胞培养板在室温平衡10分钟(通常不宜超过30分钟)。
    b.96孔板每孔加入100μl CellTiter-Lumi™ Steady Plus发光法检测试剂(384孔板每孔25μl)。
    c.室温振荡2分钟,以促进细胞的裂解。
    d.室温(约25℃)孵育10分钟,使发光信号趋于稳定。
    e.使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪进行化学发光检测。请根据仪器要求设置相应的参数,每个孔的检测时间一般为0.25-1秒或更长时间,具体需根据仪器的检测灵敏度进行适当的调整。
    f.根据化学发光读数直接计算细胞的相对活力,或根据ATP标准曲线计算出ATP的量从而计算出细胞的相对活力。对于培养细胞和ATP标准品的检测效果可以参考图1和图3,细胞在0-50,000个细胞/孔的细胞密度范围内有良好的线性关系,ATP标准品0-10,000nM浓度范围有良好的线性关系。注:检测效果因细胞的种类不同而有所不同,对于一些ATP含量特别高的细胞,在细胞数量达到50,000个后可能会不呈现线性相关,但化学发光读数还是会继续升高的。

    图3. CellTiter-Lumi™ Steady Plus发光法细胞活力检测试剂盒(CTL Steady Plus)对ATP标准品的检测效果。实际检测效果会因检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。
    常见问题:
    1.Luminometer和荧光分光光度计有何不同?
    荧光分光光度计检测的样品本身不能发光,样品需要由特定波长的激发光激发,然后才能产生荧光并被荧光分光光度计检测。Luminometer检测的样品本身可以发光,不需要激发光进行激发。也就是说luminometer是检测化学发光(萤光)的仪器。有些型号的荧光分光光度计也具有luminometer的功能,即也可以检测化学发光。您所使用的荧光分光光度计能否用于化学发光的测定请仔细阅读该仪器的说明书。
    2.可以进行萤光素酶报告基因检测的仪器是否就可以用于本试剂盒的检测?
    是。萤光素酶报告基因的检测原理和本试剂盒的原理相同,可以用相同的仪器测定。