乳酸脱氢酶细胞毒性检测

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2020/12/4
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     方法一:LDH释放检测

     

    a.根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中,使待检测时细胞密度不超过80-90%满。
    b.吸去培养液,用PBS液洗涤一次。换新鲜培养液(推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液),将各培养孔分成如下几组:包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔),未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔),未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔),以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔),并做好标记。按照实验需要给予适当药物处理如加入0-10μl左右特定的药物刺激,可设置不同浓度,不同处理时间,对照孔中需加入适当的药物溶剂对照),继续按常规培养。到预定的检测时间点前1小时,从细胞培养箱里取出细胞培养板,在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂,加入量为原有培养液体积的10%。加入LDH释放试剂后,反复吹打数次混匀,然后继续在细胞培养箱中孵育。
    c.到达预定时间后,将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl,加入到一新的96孔板相应孔中,随即进行样品测定。
    方法二:细胞内总LDH的检测
    a.细胞毒性检测:根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养孔板中,使待检测时细胞密度不超过80-90%满。加入不同药物进行处理,并设置适当对照。药物刺激完毕后,将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。尽量吸除上清,加入150μl用PBS稀释了10倍的试剂盒提供的LDH释放试剂(10体积PBS中加入1体积LDH释放试剂并混匀,适当摇晃培养板混匀,然后继续在细胞培养箱中孵育1小时。随后将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl,加入到一新的96孔板相应孔中,随即进行样品测定。
    b.细胞增殖检测:根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养孔板中,使促进细胞增殖的药物刺激后细胞不超过80-90%满为宜。使用不同的药物刺激细胞,并设置适当对照。药物刺激完毕后,将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。尽量吸除上清,加入150μl用PBS稀释了10倍的试剂盒提供的LDH释放试剂(10体积PBS中加入1体积LDH释放试剂并混匀),适当摇晃混匀胞,然后继续在细培养箱中孵育1小时。随后将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔上清液120μl,加入到一新的96孔板相应孔中,随即进行样品测定。
    注:LDH释放检测更加常用一些,细胞内总LDH检测通常可以使用MTT、WST-1或CCK-8等方法替代。
    2. 试剂盒的准备工作:
    a.INT溶液(1X)的配制:根据所需的INT溶液(1X)的量,取适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X。例如,取20μl INT溶液(10X),加入180μl INT 稀释液,混匀后即配制为200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜现配现用,配制后4℃保存可于当天使用,不宜配制后冻存。
    b.LDH检测工作液的配制: 根据待测定的样品数(含对照),参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液。
    注意:LDH检测工作液必须现配现用,配制和使用过程中均要注意适当避光。

    检测次数 1次 10次 20次 50次
    乳酸溶液 20μl 200μl 400μl 1ml
    INT溶液(1X) 20μl 200μl 400μl 1ml
    酶溶液 20μl 200μl 400μl 1ml
    总体积 60μl 600μl 1.2 ml 3ml

    c.(选做)如果希望进行LDH酶活性的绝对定量,需自备LDH标准品,并新鲜配制不同浓度LDH标准品,如10mU/ml、5mU/ml、2.5mU/ml、1.25mU/ml、 0.65mU/ml、0 mU/ml。
    3. 样品测定:
    a.各孔分别加入60μl LDH检测工作液。
    b.混匀,室温(约25℃) 避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一 波长作为参考波长进行双波长测定。
    c.计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)
    d.细胞毒性或死亡率(%)=(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度) / (细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100
    e.可绘制细胞毒性曲线:纵座标为实际吸光度,横坐标为药物浓度;据此可计算该药物作用特定时间的半致死剂量LD50。

    附录1:
    可同时测定一已知浓度的LDH酶标准品对应的吸光度值,参考以下公式粗略计算出样品中LDH酶活力:
    待测样品中LDH活力单位(mU/ml)=
    (样品孔吸光度-背景空白对照孔吸光度) / (标准管吸光度-标准空白管吸光度)×标准品浓度(mU/ml);
    根据计算结果可以比较不同样品处理组间有无统计学差异等。

    附录2:
    若需准确计算出LDH酶活性的绝对活性,可通过一系列LDH标准品及相应测得的吸光度值绘制标准曲线,通过标准曲线相应公式计算出样品中LDH的酶活性。
    各孔数值减去空白对照后,以检测的吸光度(OD490)为纵坐标,LDH酶活力(mU)为横坐标,绘制LDH标准曲线。同时计算出该趋势线的公式。

    A490nm=k×LDH酶活力单位(mU)+b,通过Excel等软件计算 出趋势线的斜率k和截距b。
    根据上述公式计算样品中LDH活力。
    样品实际吸光度(OD490)=样品孔测得的吸光度-背景空白对照孔吸光度
    检测体系中LDH酶活力单位(mU)=(OD490-b)/k
    样品中LDH酶活力(mU/ml)=检测体系中LDH酶活力单位(mU )/检测样品体积