细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2020/12/4
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     1. 准备溶液:室温融解试剂盒中的三种试剂,溶解后立即放置在冰上,混匀。取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。
    2. 对于贴壁细胞:用PBS洗一遍,用细胞刮子刮下细胞,或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧,并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。尽量避免用胰酶消化细胞,以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
    3. 对于悬浮细胞:用PBS洗一遍,离心收集细胞,尽最大努力吸尽上清,留下细胞沉淀备用。
    4. 每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。(对于二百万HeLa细胞,其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。)
    5. 最高速剧烈Vortex 5秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。(如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开,可以适当延长vortex时间。)
    6. 冰浴10-15分钟。
    7. 加入细胞浆蛋白抽提试剂B 10微升。最高速剧烈Vortex 5秒,冰浴1分钟。
    8. 最高速剧烈Vortex 5秒,4℃ 12,000-16,000g离心5分钟。
    9. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞浆蛋白。可以立即使用,也可以冻存。(千万不要触及沉淀,可以在沉淀上方保留极小体积的上清,以免触及沉淀。每200万细胞用200微升本产品中的细胞浆蛋白抽提试剂A裂解后可获得的上清,其细胞浆蛋白浓度约为2-5mg/ml,不同细胞有所不同。)
    10. 对于沉淀,完全吸尽残余的上清,加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。(不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。)
    11. 最高速剧烈Vortex 15-30秒,把细胞沉淀完全悬浮并分散开。然后放回冰浴中,每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex 15-30秒,共30分钟。
    12. 4℃ 12,000-16,000g离心10分钟。
    13. 立即吸取上清至一预冷的塑料管中,即为抽提得到的细胞核蛋白。可以立即使用,也可以-70℃冻存。每200万细胞用50微升本产品中的细胞核蛋白抽提试剂裂解后获得的上清,其细胞核蛋白浓度约为1.2-3.0mg/ml,不同细胞有所不同。
    14. 对于新鲜组织:
    a. 把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B(例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B)。并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液(对于不超过30mg的组织样品,仅需加入100微升组织匀浆液),并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。
    b. 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内,冰浴放置15分钟。
    c. 4℃ 1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中,为抽提得到的部分细胞浆蛋白。(吸上清时千万不要触及沉淀。)
    d. 对于沉淀,到了这一步已经充分匀浆,但很多细胞还没有破碎。接下去按照使用说明的步骤4开始操作,即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作,按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白(特别说明:对于起始量为30-60mg的组织样品,后续直接按照步骤4-13操作即可;对于起始量不超过30mg的组织样品,后续步骤4-13中的溶液的用量须减半使用)。抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14c中抽提得到的细胞浆蛋白合并。新鲜的肝脏组织用本产品裂解后获得的上清,其细胞浆蛋白浓度约为3-10mg/ml,细胞核蛋白浓度约为3-10mg/ml,不同状态的不同组织有所不同。