活细胞间接免疫荧光法

一．实验器材：

1．  器材：

40孔塑料板、40孔板离心机、微量加样器、振荡器、盖玻片、荧光显微镜等

2．  试剂：

单抗隆抗体（单抗）、荧光标记抗鼠免疫球蛋白、PBS（pH7.2-7.4）、甘油、叠氮钠（NaN3）等

二．方法（微量法）

1．  将分离好的单个核细胞用PBS洗2次，1000rpm每次10分钟。用含0.1% NaN3 PBS调细胞浓度在0.5-1×108/ml（5000万-1亿/ml），加在40孔板上，每孔10ul，含5-10×105细胞，然后加入单抗（第一抗体）50ul（同时加入AB型血清5ul）振荡混匀，置4℃，至少30分钟。

2．  用含0.1%NaN3的PBS洗一次，1000rpm离心3-5分钟弃上清。

3．  加荧光标记抗鼠抗体（第二抗体）工作液20ul，混匀振荡置4℃/30分钟（时间不能超过）。

4．  用含0.1%NaN3的PBS洗2次，方法同上，弃上清，加入含60%甘油的PBS5-10ul（依据所加细胞量而定）振荡均匀，点片，并加盖玻片。

如想次日看结果可在第三步后每孔加入1%多聚甲醛PBS每孔

50ul，混匀置4℃过夜，次日离心弃上清按四步做法观察结果（为膜荧光）。