产品内容：
试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体0.6mL×1支，-20℃保存；
试剂三：液体55mL×1瓶，4℃保存；
试剂四：粉剂×1支，4℃保存；
试剂五：粉剂×1支，4℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂七：粉剂×1支，-20℃保存；
试剂八：粉剂×1支，-20℃避光保存。临用前加入2mL双蒸水充分混匀待用，用不完的试剂仍-20℃保存。
工作液的配制：临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用。
 
产品说明：
   α-KGDH（EC 1.2.4.2）广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中，是三羧酸循环调控关键酶之一，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A。
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶A生成琥珀酰辅酶A、二氧化碳和 NADH，NADH在340 nm有特征吸收峰，以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
 
试验所需自备仪器和样品：
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、α-KGDH的提取
称取约0.1g组织或收集约500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂二，冰浴用匀浆器或研钵充分研磨，4 ℃ 11000 g离心10min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热30min以上，调节波长到340 nm，蒸馏水调零
2. 空白管：
取1mL工作液加入1mL石英比色皿，37℃孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL试剂八和60μL蒸馏水，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A1，37℃准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A2，计算ΔA空白=A2-A1。
3.测定管：
取1mL工作液加入1mL石英比色皿，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）孵育5min后取出比色皿，再依次加入40μL试剂八和60μL样本，混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A3，37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）中准确反应2min，记录340nm处2min时的吸光值A4，计算ΔA测定=A4-A3。
三、α-KGDH活性计算
1.按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
 α-KGDH活性（U/mg prot）＝[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(Cpr×V样) ÷T
=1473.7×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr
2.按样本鲜重计算
单位的定义：每g1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
 α-KGDH（U/g 鲜重）＝[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(V样÷V样总×W)÷T
=1488.5×(ΔA测定-ΔA空白)÷W 
3. 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。
α-KGDH活性（U/104cell）＝[(ΔA测定-ΔA空白)÷（ε×d）×V反总×109]÷(V样÷V样总×500)  ÷T
=2.977×(ΔA测定-ΔA空白)
V反总：反应体系总体积，1.1×10TUNEology 波长可调检测卡盒-->