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TALEN靶向基因敲除技术服务

TALEN靶向基因敲除技术服务

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产品名称： TALEN靶向基因敲除技术服务

英文名称： TALEN靶向基因敲除技术服务

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上海英拜生物科技有限公司
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服务介绍

         TALE（Transcription Activator-Like (TAL) Effector）靶向基因操作技术是一项崭新的分子生物学工具，是基因功能研究领域的一项重大技术突破。研究人员发现，来自植物病原菌Xanthomonas的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。基于这一对应关系，利用TAL的序列模块构建特异性结合任意DNA序列的重组蛋白，可实现操作目标基因的目的。
       1）TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases）技术，构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特定位点打断目标基因DNA，进而进行DNA操作。
       2）TALE-TF (transcription activator-like (TAL) effector - transcription factors )技术，针对特定基因启动子上游任意DNA序列构建转录激活因子，从而提高内源基因的表达水平。

a. TALEN的技术优势：与ZFN比较，优势明显。

  TALEN ZFN
成 功 率 几近100% 不足10%
费       用 较低 高
实验设计 简单 复杂
实验周期 短 长
细胞毒性 低 较高
脱靶情况 低 高
打靶特异性 高，无基因序列、细胞、物种限制 无法识别任意目标序列，且识别序列常受上下游序列影响

b. TALEN的应用趋势：自2010年该技术被首次报道以来，使用TALEN技术发表的SCI文章逐年递增。

c. TALEN已成功应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象。

       应用案例：Zic2 knockout，小鼠尾巴卷曲。(Davies B, Davies G, Preece C, Puliyadi R, Szumska D, et al. (2013) Site Specific Mutation of the Zic2 Locus by Microinjection of TALEN mRNA in Mouse CD1, C3H and C57BL/6J Oocytes. PLoS ONE 8(3): e60216.)

针对Zic2的Exon2设计了两个独立的 TALEN-A、TALEN-B
TALEN-A、TALEN-B作用后，surveyor assay 检测到目的基因都有突变
TALEN-A、TALEN-B作用后，目的基因启动子都出现缺失或插入突变                                                           
TALEN-A、TALEN-B作用后，不同品系的小鼠都出现了尾巴卷曲

服务内容

1. TALE识别模块的构建

       TAL的核酸识别单元为34个氨基酸的重复序列，每个重复序列仅第12、13两位点的氨基酸发生变化，这两个氨基酸被称为RVDs(Repeat-Variable Di-residues)，并且与A、T、C、G有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G/A。因此，为了识别某一特定核酸序列，只需按照其DNA序列将相应的TAL单元串联克隆即可。由于物种基因组大小不同，选择的特异序列长度也不同；对于哺乳类动物（包括人类），一般选取16-20bp的DNA序列作为识别靶点。

 

2. TALEN质粒对的构建

       TALEN质粒构建：将识别特异靶DNA序列的TALE与核酸内切酶FokI偶联，FokI须形成二聚体方能发挥活性。因此，在目标基因的编码区选择间隔13-22bp的两段16-20bp序列，分别克隆形成真核表达载体，得到TALEN质粒对。

 

3. TALEN基因敲除/同源重组

       TALEN质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白即分别与其DNA靶位点特异性结合。同时，两个TALEN融合蛋白中的FokI核酸内切酶形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间打断目标基因，形成DSB（Double-Strand Breaks），诱发DNA损伤修复机制。细胞即通过非同源重组NHEJ（Non-homologous End Joining）方式修复DNA，由于缺乏修复模板，或多或少会删除或插入一些碱基，造成移码，使得目标基因失活，形成目标基因敲除突变体。若有同源修复模板，细胞可通过同源重组HR (Homologous Recombination)方式修复DNA，便可对目标DNA做更精细的修饰，如点突变（磷酸化位点）、碱基替换、加标记（GFP、Flag…）等等。

 

4. TALE-TF转录激活

       将识别特异DNA序列的TALE与转录因子激活区域VP64(VP64 Activation Domain)融合，构建识别启动子上游特异DNA序列的转录激活因子TALE-TF。转染目标细胞后，便可精确激活目标基因转录，提高其表达水平。

 

5. TALEN活性检测

      1) 套峰法 TALEN质粒转染细胞系1-2天后，提取基因组DNA，PCR扩增靶位点序列后送测序，通过spacer区域出现的套峰情况来评价TALEN活性。

 

      2）错配酶法 靶序列PCR扩增后经变性-退火、错配酶（MSDase）处理，杂合双链即被切断。消化产物跑电泳，比较切割条带与非切割条带的比例，即可反映出TALEN的活性高低。

 

      3）限制性内切酶法 通过设计位于相邻靶位点之间的特异性内切酶位点，便可酶切鉴定PCR产物以筛选发生目标基因敲除的突变个体。

 

服务流程