细胞复苏

注意:1.低温保存的细胞非常脆弱，请将冻存管放入37C的水中解冻，尽快复苏细胞2.提前室温预热培养基。

1.在无菌区准备好 15ml 离心管和 T-25 培养瓶并分别加入 5ml 完全培养基

2.将冻存管放入37C水浴锅中，握住冻存管不停晃动，直到内容物完全融化。然后立即将冻存管从水浴中取出，擦干并喷洒 75%乙醇，移至无菌区;

3.小心地拆卸盖子，不要碰到里面的螺纹，用移液枪轻轻吸出细胞悬液，加入到准备好的 15ml离心管中，1000rpm 离心 5min;

4.弃上清后，轻弹离心管底部分散细胞沉淀，加入适量完全培养基重悬细胞后转入准备好的 T25 培养瓶(建议加液量: 5~7ml) :

5.轻轻摇动培养瓶使细胞均匀分布，如有必要(如使用不透气瓶)，松开阀盖，以便气体交换。

6.将培养瓶放入 CO2 培养箱中培养

细胞传代

收到细胞后，请对细胞培养瓶外表进行消毒，将细胞置于培养箱中进行 1-2 小时的缓冲待细胞恢复基本生长状态后，进行后续细胞实验。在倒置显微镜下观察整个细胞生长情况:(一)细胞未长至 85%时，用 75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到生物操作台内，严格无菌操作，打开细胞培养瓶，若培养瓶上无特殊标注，吸去剩余培养液，只留 6-8ml 培养液继续培养。

(二)细胞已长满(达 85-95%) 。即可进行传代，具体步骤如下:

1.弃去培养液，用 PBS 洗涤 1-2 次;

2.加入 1.0ml 胰酶消化液，37C消化约 3min，显微镜下观察细胞消化情况，若细胞回缩变圆、透亮、轻拍瓶壁呈流沙样脱落，则迅速拿回操作台，加入至少双倍的完全培养液终止消化并轻轻吹打细胞 1-2 次，使其变成单细胞悬液:

3.将细胞收集于离心管中离心 1000rmp/5min，弃上清，轻弹管底，将细胞弹散;

4.加入新鲜培养基重悬细胞，进行传代;5.如果没有特别说明，建议收到细胞后的第一次传代比例为 1:2。

注:1.观察胞度最好用(4 物倍观确的断胞度，观察胞形态请用10X或20X)高倍观察

2推使用0.25%胰酶/EDTA 消化液

3.瓶中运输的培养液不能重复使用，请换新鲜培养液培养;

4.有些细胞贴壁不牢，如发现贴壁细胞有脱落，可离心重悬后接种到新瓶内