产品内容： 

提取液一：25mL×1 瓶，4℃保存；

提取液二：25mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体25mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：液体14μL×1 支，4℃保存；

产品说明：

GAPDH 催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途径的关键酶，与糖异生途径、体内血糖浓度的维持和糖尿病的发生密切相关，在机体糖、脂、蛋白代谢紊乱疾病中发挥重要作用。

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP 生成1,3 二磷酸甘油酸。GAPDH 逆向催化1,3二磷酸甘油酸和NADH 生成3 磷酸甘油醛、无机磷和NAD，340nm 处测定NADH 的减少量可反映GADPH 活性的高低。

需自备的仪器和用品

分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

1、 组织样品的前处理

（1）总GAPDH酶提取：建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔7s，总时间1min），然后8000g 4℃离心10min，取上清测定。

（2）胞浆和叶绿体GAPDH酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液一），冰浴匀浆后于4℃ ，200g离心5min，弃沉淀，取上清在4℃8000g离心10min，取上清用于测定胞浆GAPDH酶的活性。取沉淀加入1ml提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔7s，总时间1min），然后4℃8000g离心10min，取上清测定叶绿体GAPDH酶的活性。

建议测定总GAPDH酶活性，按照步骤（1）提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和线粒体中的GAPDH，则按照步骤（2）提取粗酶液。

2、 细菌或培养细胞的前处理

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液一体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

（1）工作液的配制：将试剂二全部倒入试剂一瓶中，充分溶解，37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)预热10 分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2）在试剂三中加入500μL 蒸馏水，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（3）在1mL 石英比色皿中加入30μL 样本、20μL 试剂三和950μL 工作液，混匀，加入最后一个试剂的同时开始计时，记录340nm 处20s 时的吸光值A1 和 5min20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

三、GAPDH 活性计算

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=1072×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T

=1072×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

GAPDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T

=2.14×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。