定点突变试剂盒
产品名称： 定点突变试剂盒
英文名称： Hieff Mut™ Site-Directed Mutagenesis Kit
产品编号： 11003YB10
产品价格： 0
产品产地： 中国/美国
品牌商标： 钰博生物/Ybscience
更新时间： 2023-08-17T10:29:50
使用范围： null
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定点突变试剂盒
产品信息
产品描述
Hieff MutTM Site-Directed Mutagenesis Kit是基于Hieff CloneTM快速克隆技术的定点突变系统。使用本试剂盒，目标质粒扩增产物经DpnI消化、Hieff CloneTM重组环化后直接进行转化即可完成定点突变。该试剂盒由两个模块组成：HieffTM II Pfu DNA Polymerase扩增模块和Hieff CloneTM快速克隆模块。HieffTM II Pfu DNA Polymerase超高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性，其卓越的长片段扩增能力，广泛适用于长度小于20 kb的任何质粒扩增。Hieff CloneTM快速克隆系统利用高效的同源重组反应替代传统的退火成环反应。因此使用Hieff MutTM Site-Directed Mutagenesis Kit进行DNA定点突变时，引物设计更加灵活，且扩增反应不再需要以线性方式进行，极大减少了模板使用量，有利于原始甲基化模板的彻底降解。Hieff CloneTM技术可以高效完成两个PCR产物的无缝拼接，因此该试剂盒还能以单次扩增的方式对目标质粒上不连续的两个位点同时进行突变。
Hieff MutTM Site-Directed Mutagenesis Kit中的重组酶Exnase经过优化，专门针对单碱基、不连续双碱基定点突变。此外，如扩增产物特异，其DpnI消化产物可不进行DNA纯化而直接用于重组反应。高度优化的反应缓冲液、快捷的操作流程以及极高的成功率，使得Hieff MutTM Site-Directed Mutagenesis Kit成为DNA定点突变首选试剂盒。
定点突变试剂盒应用范围
DNA定点突变
【注】：如使用本品对质粒进行定点突变，请使用甲基化酶无缺陷的宿主菌 (例如Top10、DH5α、JM109)扩增原始质粒！
产品组成
冰袋（wet ice）运输。产品-20 ºC保存。有效期1年。
单碱基或连续多碱基定点突变实验流程
实验流程概览（图一）
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1. 引物设计
向质粒引入单碱基或连续多碱基定点突变，只需设计一对引物将质粒进行反向PCR扩增即可。引物设计基本原则为：正反向扩增引物5’端包含至少20 bp反向互补区域，各引物非互补区域长度至少为20 bp。所需引入突变可以包含在互补区域内 (需要两条引物上均引入点突变)，也可以包含在任一条引物的非互补区域 (只需在一条引物上引入点突变)，请勿将突变位点置于引物末端。以向pUC18引入单碱基突变为例，引物设计具体方案如图二所示。
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注意：计算引物Tm值时，应计算待突变位点至引物3’端这一区域内的碱基，待突变位点至引物5’端区域内的碱基不应参与计算。
2. 目标质粒扩增
2.1 配制PCR反应体系
反应各组分解冻后请充分摇匀，使用完毕后及时放回-20℃。2×HieffTM II PCR buffer请勿长时间敞口放置。
为了增加扩增特异性，反应体系配制过程请于冰水浴中进行。为了防止HieffTM II Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物，请将聚合酶最后加入反应体系中。
a. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
b. 在质粒能正常扩增的前提下，应尽量减少质粒模板使用量，推荐使用≤1 ng新鲜提取的质粒做模板。
c. 推荐的酶的终浓度为1 U/50 μl反应。可将HieffTM II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之间进行优化，但不要超过2 U/50 μl，尤其当扩增子长度大于5 kb时。
2.2 PCR扩增反应
推荐PCR反应条件：
a. 对于大多数质粒，变性温度使用95℃即可。
b. HieffTM II Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说，退火温度设置为引物Tm值即可。如果需要，可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。
c. 对于大多数扩增反应，延伸过程可在72℃进行。长的延伸时间有助于提高扩增产量。
d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变，强烈建议扩增循环数≤35。如果扩增效率良好的话，推荐扩增循环数≤30。
反应结束后取少量扩增产物进行琼脂糖电泳检测。如目标质粒正确扩增，则可进行下步实验。
3. 扩增产物DpnI消化，去除甲基化模板质粒
因上述扩增产物中包含原始模板质粒，为防止其在转化后形成假阳性转化子，必须在进行重组环化之前进行DpnI消化。
推荐反应体系如下：
轻轻吹打混匀后，将上述反应体系置于37℃恒温反应1～2小时。如产物扩增特异，产物条带单一，DpnI消化产物无需纯化，可直接用于后续重组反应。如扩增不特异，DpnI消化结束后应胶回收纯化目标扩增产物。
定点突变试剂盒4. 重组反应
4.1 配制重组反应体系
正反向扩增引物5’端包含完全反向互补的一段序列，因此在Exnase催化下扩增产物5’末端和3’末端可以发生同源重组，完成扩增产物环化过程。于冰水浴中，将下列组分依次加到无菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎将液体粘在管壁，请务必通过短暂离心使其沉入管底。体系配制完成后，用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分，避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。