产品内容：

试剂一：液体60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体1mL×1 支，-20℃避光保存；

试剂三：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×1 支，4℃保存；

试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×1 支，4℃保存；

试剂七：粉剂×1 支，4℃保存；

工作液的配制：临用前把试剂四、五、六、七转移到试剂三中混合溶解待用；用不完的试剂 4℃保存一周。

产品说明：

    PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。PDH催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致605nm光吸收的减少。

试验所需自备仪器和样品：

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本的处理

    称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入1mL 试剂一和 10μL试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4 ℃ 11000 g离心10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、分光光度计预热 30min以上，调节波长至 605nm，蒸馏水调零。

2、每个样本需要900μL工作液，按样本数加一取出一定量的工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中孵育5min。

3、空白管：在1mL比色皿中加入900 μL工作液和50μL水，混匀，立即记录605nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算 ΔA空白=A1-A2。

4、测定管：在1mL 比色皿中加入900 μL工作液和50μL样本，混匀，立即记录 605nm 处初始吸光值A3和1min后的吸光值A4，计算ΔA测定=A3-A4。

三、PDH 活性计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性（U /mg prot）=[(ΔA测定-ΔA空白)×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T

=904.762×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH活性(U/g鲜重)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T

=913.81×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH 活性(U/10⁴ cell)=[(ΔA测定-ΔA空白)×V 反总÷(ε×d)×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T

=1.828×(ΔA测定-ΔA空白)

 V 反总：反应体系总体积，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

注意事项：

1、测定过程中所有样本在冰上放置，以免变性和失活。

2、测定管的ΔA值在0.01-0.25之间，若测定管的ΔA值大于0.25，需将样本进行稀释。 

相关文献：

《Engineering Corynebacterium glutamicum for high-titer biosynthesis of hyaluronic acid.》 作者:Fangyu Cheng,Huimin Yu,Gregory Stephanopoulos 期刊:Metab. Eng. 影响因子:7.808 PMID:31301358