差减cDNA文库构建

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服务概述

差减文库也称扣除文库，使用两种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料(如不同基因处理细胞系或植物的近等基因系等)提取  mRNA  (反转录后合成  cDNA)，在一定条件下用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子(Driver )与含有目的基因的试验方(Tester)进行杂交，选择性的祛除两部分共同基因杂交形成的复合物，往往进行多次的杂交—祛除过程，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。构建差减  cDNA  文库的关键是RNA质量以及差减杂交的效率。差减杂交的方法主要有(1)羟基磷灰石柱层析法  (HAP)；(2)生物素标记、链亲和蛋白结合排除法；(3)限制性内切酶技术相结合的差减方法；(4)差减抑制杂交法  (SSH)；(5)磁珠介导的差减法  (MAST)，其中  SSH  法最为常用。 初始基因文库库容量 1 × 106pfu 以上，如需扩增，扩增后容量1×109pfu 以上；插入片段平均长度 1.0~1.5kb( 非常规物种不承诺 ) ；重组效率大于 90 ％（质粒文库） , 大于 70%( 噬菌体文库 ) ； cDNA 的完整性，读框完整比例 ≥30% 【仅对长度为 3 kb 以下的基因而言】。

样品要求

材料要求新鲜、RNA无降解；样品量：组织（2~3g），细胞（10 8），总RNA量50~100μg（>0.3μg/μl）或mRNA量2~3μg（>0.3μg/μl）；最低总RNA量为2~3μg（>300ng/μl），最低mRNA量为0.2~0.3μg（>30ng/μl）。其余详见“文库构建”中的要求。

服务流程

提取总RNA，纯化mRNA，反转录合成cDNA第一链，通过引物延伸合成双链cDNA；或（材料有限的情况下）提取总RNA，反转录合成cDNA第一链，通过LD-PCR合成双链cDNA。然后将双链cDNA酶切，与接头连接，正反杂交反应，差异表达cDNA的扩增，连接到T-载体，转化及保存，序列测定。

完成时间

6~8周内完成。对于有些RNA难以抽提的材料或样品材料本身质量问题，时间较长，会在1周内和客户协商约定时间。

最终产品

 1.电泳图谱；

 2.初始库，保存在-20 ℃ ； 

3.文库评价数据，包括库容量，插入片段平均长度，重组效率 , cDNA 完整性评价等

服务费用

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