ChIP实验概述

来源: 上海雅吉生物科技有限公司   2021-4-6   访问量:450评论(0)

染色质免疫沉淀ChIP)被用于检测细胞核天然染色质结构内的蛋白质与DNA之间的相互作用。传统的ChIP实验首先需要将细胞固定,这使得蛋白质与DNA相互作用交联固定到位。然后利用酶或者超声的方法将染色质打断为片段,使用抗体对感兴趣的蛋白质以及与其结合的DNA进行免疫沉淀。最后解交联,对沉淀DNA进行纯化。纯化的DNA可进行进一步分析,如标准或定量PCR或测序。

这些实验对染色质的完整性、抗原表位的稳定性以及免疫沉淀抗体的特异性较为敏感。这些变量在所研究的蛋白质与DNA相互作用具有较低的丰度和稳定性时变得更为关键。

ChIP实验可以主要包括以下几个步骤:

交联固定染色质剪切免疫沉淀DNA纯化DNA检测

(1)交联固定

一般采用1% formaldehyde(甲醛)室温交联10-30分钟,交联的目的是为了建立蛋白质/DNA之间的稳定共价连接,这个过程要注意一下几点。(1)一定要使用新鲜甲醛溶液,因为甲醛容易被氧化,导致交联不充分,在后续染色质剪切的时候则容易破坏蛋白和DNA的共价连接。(2)交联的时间10-30分钟,如果研究对象为转录因子等丰度比较高,和DNA结合也很稳定,交联10min即可,如果研究对象为转录辅因子等丰度比较低,也不是直接与DNA结合,则适当延长交联时间至30min

(2)染色质剪切

根据染色质剪切方式的不同,目前市面上提供两种试剂盒,酶解法和超声法的试剂盒。

酶解法则是在交联处理之后,加入适量的核酸酶特异性的切割核小体,将核小体切割成以1个、2个……核小体为单位的片段。到这里,有些小伙伴可能就摩拳擦掌准备接下来的免疫沉淀了,但是小优提醒您,酶解之后,样品并没有完全切割好,还需要经过短暂的超声处理,把细胞膜和核膜充分打碎,使染色质片段完全释放出来。

如果是超声法,则比较简单了,调整到合适的超声功率,将样品超声处理适当的时间就好了。在这个过程中要摸索好超声的条件,过度超声有可能破坏染色质完整性,会给ChIP实验富集带来负面影响,尤其是转录因子和辅因子。

到这里您可能会想,既然酶解和超声法都有超声处理,那为什么不直接选择超声法呢?这里要跟各位小伙伴强调一下了,酶解法后期的超声时间相对较短,20-30S的超声时间即可,所以相对而言比较好控制实验条件,对于没有做过ChIP实验的老师而言,也比较好操作了。超声法因为对超声的功率和时间要求较高,适用于实验室条件比较成熟的老师。

(3)免疫沉淀

向样品中加入抗体将目的蛋白和连接的DNA拉下来。这个过程中引入protein G微珠,将目的蛋白和与它结合的DNA拉下来,这个过程中或多或少也会把其他杂蛋白一起拉下来,所以接下来进行高盐和低盐的洗脱,去掉杂质。

在这个过程中选择合适的抗体对实验结果至关重要。如果您需要做测序,则要选择ChIP-seq级的抗体,如果只是做PCR,选择ChIP级抗体即可。因为ChIP级抗体除了要结合完全裸露的靶蛋白之外,还要结合因构象变化被DNA遮蔽的抗原表位,而ChIP-seq则需要检测全基因组上大量的成千上万的基因位点。所以要严格选择相应级别的抗体。

(4)DNA纯化

用蛋白酶K解交联,消化染色质的蛋白质组分和DNA之间的连接,然后经过DNA纯化柱对样品进行纯化。

5DNA检测

纯化好的DNA进行PCR或者测序分析。

CST提供的ChIP试剂盒有以下5,您可以根据样品和实验的需求进行选择:



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