免疫(共)沉淀操作指南与常见问题解答

来源: 上海雅吉生物科技有限公司   2021-4-6   访问量:365评论(0)

简介:免疫(共)沉淀(IP/Co-IP)是基于抗体和蛋白的特异性亲和作用,通过捕获与蛋白或抗原特异性结合的抗体,进而从复杂的样品中捕获及富集目标蛋白,同时可以测定与之相互作用的蛋白或其它生物大分子。


实验前:

为了获得更好的实验结果,所有的步骤均需要根据实际情况进行优化。例如:根据细胞系或被捕获的抗原后续用途的不同可选择更加合适的细胞裂解条件。对于没有细胞壁结构的哺乳动物细胞,可以直接使用去污剂进行裂解,但其它细胞,则需要一些机械剪切力辅助,例如超声破碎。以下列出的(包括裂解液、孵育时间、体积及浓度)是作为初始尝试的条件建议,最终的优化需要根据实际情况调整。

另外,细胞裂解物在进行免疫(共)沉淀前,可先进行蛋白免疫印迹法检测,以此来确定细胞裂解物里存在目标蛋白。


A. 溶液和试剂

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节分子的新鲜培养基,使其在预定的时间内对细胞进行处理。

2. 收集细胞,去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。

3. 去除 PBS 并在每个细胞板上 (10 cm) 加入 0.5 ml 冰预冷的 Lysis buffer,并在冰上孵育至少 5 分钟。

4. 从板上刮下细胞,把提取物转移至微量离心管。置于冰上。

5. 在冰上进行 3 次超声破碎,每次 5 秒。

6. 在 4°C,在 14,000 x g 条件下,微量离心 10 分钟,将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要,裂解物可保存在 –80°C。 注:细胞裂解物制备好之后,可先进行蛋白免疫印迹法检测,以此来确定细胞裂解物里存在目标蛋白。


C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预清除(可选步骤)

1. 向500μl(含总蛋白200-1000ug) 细胞裂解物中添加 5μl Protein A和5μl Protein G。

2. 在 4°C 下,旋转孵育30-60分钟。 3. 4°C 条件下12000g离心1min,保留上清,待用。


抗原抗体结合

1. 在新的离心管内加入500μl(含总蛋白200-1000ug)细胞裂解物(可以是预清洗后的细胞裂解物)。

2. 加入目标蛋白的单克隆/多克隆抗体(1-5μg),

3. 同时采用非特异免疫的同源抗体作为对照。 4. 在4℃轻柔混合过夜。


免疫复合物沉淀

1. 抗体孵育过夜后,加入5μl Protein A和5μl Protein G。 2. 在4℃温和地混匀1-3小时或过夜。

3. 12000g离心1min,保留沉淀。 4. 使用0.5ml 1*Wash buffer清洗沉淀,12000g离心1min,保留沉淀。

5. 重复第4步,共计清洗3次。

注:清洗,去上清的时候需要注意避免吸走填料


D. 用蛋白免疫印迹法进行分析

1. 在 20-40 μl 1* SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物。涡旋振荡,然后再微量离心 30 秒。

2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5分钟,然后在 14,000 x g 下瞬时离心 1 分钟。

3. 将样品 (15-30 μl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。

4. 用蛋白质印迹法分析样品。


IP/Co-IP常见问题解析

Co-IP出现假阳性

考虑抗体特异性,使用特异性更高抗体;适当降低抗体浓度。

Co-IP实验结果检测到重链或轻链

用兔IgG作为对照,排除影响;用抗Fab和Fc抗体特异性封闭重链和轻链;选择不识别重链和轻链二抗使用。

Co-IP未检测到与目的蛋白相互作用的蛋白或信号太弱

裂解液中的去垢剂浓度太高或配方过于剧烈,降低去垢剂浓度或更换去垢剂种类;蛋白与蛋白之间的相互作用太弱或不太稳定,应选择亲和力更高的抗体以捕获更多目的蛋白,从而捕获更多的相互作用蛋白,过表达提高目的蛋白的含量,选择目的蛋白或相互作用蛋白含量高的样品进行免疫共沉淀实验。

IP/Co-IP实验失败原因有哪些?

样品被蛋白酶降解。可添加蛋白酶抑制剂(protease inhibitor);所有操作保持4℃以下冰上操作并防止冻融。

抗体浓度太低。调整使用抗体浓度, 必要时设立浓度梯度,摸索最佳浓度。抗体亲合力太低。选用适合于实验的相应抗体。IP抗体未与agarose珠子结合。选用适合于IP的相应珠子,正确保存防止变质或干燥。



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