Bioss讲堂|WB内参选择知多少?

来源: 北京博奥森生物技术有限公司   2021-1-18   访问量:920评论(0)

免疫印迹技术 (Western blotting, WB) 是蛋白定性和定量的金标准,因此广泛应用于生物学研究。由于Western blot检测包含多个步骤,样品制备、上样或转膜等实验过程中任何细微的差异,都可能导致实验结论的不一致性,甚至完全相悖。为了避免实验操作差异引起误差,在任何WB检测实验中,都需要设定合适的内参。


WB最常见的应用是研究生物样品中蛋白质丰度的变化。内参的信号通常用来对目的蛋白的信号进行标准化,需要强调的是内参抗体应该与实验抗体在相同的印迹上进行。因此选择的内参蛋白必须是实验样本中稳定表达的蛋白,一般会选择组成型表达且是细胞基本功能必需的管家蛋白如细胞骨架蛋白作为内参。但是进一步的研究表明,管家蛋白的表达并不恒定,会因实验条件的改变而改变。


内参蛋白有多种多样的选择,随机选择beta-Actin或alpha-Tubulin作为内参并不能满足所有的WB实验,对于不同特性的WB,寻找合适的内参是特定WB成功的关键。我们在这里列出了内参选择需要遵循的原则以便大家更好的选择合适的内参。




选择内参应遵循以下原则



稳定表达:在特定实验条件下(如特殊的实验处理或不同的发育阶段),内参蛋白的水平相对于总蛋白保持恒定;

分子量大小:内参蛋白分子量与目的蛋白分子量明显不同,最好能相差 5kd 以上;

表达水平:内参蛋白应在实验样本中高表达;

丰度相似性:实验样本中内参蛋白的表达丰度应与目的蛋白的丰度有相似性,实验方案和检测方法可以揭示内参蛋白和目标蛋白水平的变化,而不会出现信号饱和;(如果内参蛋白的表达水平远远高于目的蛋白,必须对内参蛋白进行梯度稀释以确定内参蛋白的检测范围)。



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