抗体验证必知策略(三)丨正交策略—抗体数据与非抗体数据交叉佐证
关于 CST 抗体验证的标志性事件你已经知道几个? 上一期我们揭秘了第 2 种策略——范围策略,下面继续跟随小编学习 CST 完整的抗体验证系统。教你挑选值得信赖的抗体! CST 抗体验证第 3 个策略——正交策略。 抗体验证的正交策略涉及将基于抗体的结果与基于非抗体方法获得的数据进行交叉对照。这种方法对确认现有抗体验证数据至关重要,并可确定与存疑抗体直接相关的任何影响或伪影响。为了提供更多详细信息以支持本手册中概述的其他策略所产生的结果,正交验证通常利用公共可用的数据。 取决于抗原靶标,基于非抗体的方法可包括挖掘先前发表的结果,通过“组学技术”(基因组学、转录组学和蛋白质组学)以及采用其他已建立的独立于抗体的方法(例如in situ杂交或 RNA 测序 [RNA-seq])进行表达分析研究。相应地,也可以使用正交策略来确保内部进行的任何抗体验证均使用最相关的生物学模型作为目的靶标。 在最简单的形式下,正交策略要求通过基于非抗体的检测方法确证获得的其他指标结果。举一个示例,通过二元或范围策略观察到的靶标的阳性和阴性表达应始终使用正交方法进行确认,例如通过基因测序确认敲除或对 mRNA 进行转录组分析以确认表达。 正交策略包括以下几种方法: 1. 使用组学数据验证 尽管已建立的免疫染色技术(例如蛋白质印迹和免疫组织化学)可快速直观地显示抗体特异性,但至关重要的是,正交试验可支持使用这些方法生成的任何抗体验证数据。实现这一目标的一种方法是挖掘公开可用的数据库(例如,CCLE、BioGPS、Human Protein Atlas、DepMap Portal、COSMIC),获得基因组和转录组分析信息,以帮助了解观察到的免疫染色结果是否相关,还是由于抗体相关的人为因素导致错误结果。 例如,图 1 显示了使用Nectin-2/CD112 (D8D3F) Rabbit mAb 在各种细胞系中进行的 Nectin-2 蛋白印迹检测。在 RT4 和 MCF7 中表达明显升高,而在 HDLM-2 和 MOLT-4 中只能看到最低表达。这些结果通过 RT4 和 HDLM-2 细胞沉淀的免疫组织化学分析所反映(图 2),明确表明来自两种不同应用的数据与基于基因组学和转录组学数据预测的 Nectin-2 表达尤其相关,如图 3 所示。 2. 使用影像技术生成抗体验证数据 点我观看视频,探索CST抗体验证的6大策略。 CST 博 士 互 助 平 台 扫码关注CST博士互助平台,获得更多信号通路、实验技巧、科学前沿、商家活动等一手资讯。
图 1
使用 Nectin-2/CD112 (D8D3F) (上图)和 β-肌动蛋白 (D6A8) (下图)对不同人细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
图 2
使用 Nectin-2/CD112 (D8D3F) 对石蜡包埋的 RT4 细胞团块(左图,高表达)或 HDLM-2 细胞团块(右图,低表达)进行免疫组织化学分析。
图 3
人类蛋白质图谱,可从 https://www.proteinatlas.org/ENSG00000130202-NECTIN2/cell 获得
作为各种“组学”技术的补充,原位杂交、RNA-seq 和 RNAscope® 等正交方法可以检测组织中的蛋白质表达和/或定位。这些方法尤其适用于验证使用免疫细胞化学或免疫组织化学等成像技术生成的抗体数据。
图 4
使用 Olfm4 (D6Y5A) 对石蜡包埋的正常小鼠小肠 (左图)和结肠 (右图)细胞进行免疫组织化学分析。
图 5
使用 Olfm4 (D6Y5A)(上图)和 β-Actin (D6A8)(下图),对小鼠小肠 (阳性)、小鼠脾脏 (阳性)和小鼠结肠 (阴性)细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。
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