上一期我们揭秘了第 2 种策略——范围策略，下面继续跟随小编学习 CST 完整的抗体验证系统。教你挑选值得信赖的抗体！

CST 抗体验证第 3 个策略——正交策略。

1. 使用组学数据验证

尽管已建立的免疫染色技术（例如蛋白质印迹和免疫组织化学）可快速直观地显示抗体特异性，但至关重要的是，正交试验可支持使用这些方法生成的任何抗体验证数据。实现这一目标的一种方法是挖掘公开可用的数据库（例如，CCLE、BioGPS、Human Protein Atlas、DepMap Portal、COSMIC），获得基因组和转录组分析信息，以帮助了解观察到的免疫染色结果是否相关，还是由于抗体相关的人为因素导致错误结果。

例如，图 1 显示了使用Nectin-2/CD112 (D8D3F) Rabbit mAb 在各种细胞系中进行的 Nectin-2 蛋白印迹检测。在 RT4 和 MCF7 中表达明显升高，而在 HDLM-2 和 MOLT-4 中只能看到最低表达。这些结果通过 RT4 和 HDLM-2 细胞沉淀的免疫组织化学分析所反映（图 2），明确表明来自两种不同应用的数据与基于基因组学和转录组学数据预测的 Nectin-2 表达尤其相关，如图 3 所示。

图 1

使用 Nectin-2/CD112 (D8D3F) （上图）和 β-肌动蛋白 (D6A8) （下图）对不同人细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

图 2

使用 Nectin-2/CD112 (D8D3F) 对石蜡包埋的 RT4 细胞团块（左图，高表达）或 HDLM-2 细胞团块（右图，低表达）进行免疫组织化学分析。

图 3

人类蛋白质图谱，可从 https://www.proteinatlas.org/ENSG00000130202-NECTIN2/cell 获得

作为各种“组学”技术的补充，原位杂交、RNA-seq 和 RNAscope® 等正交方法可以检测组织中的蛋白质表达和/或定位。这些方法尤其适用于验证使用免疫细胞化学或免疫组织化学等成像技术生成的抗体数据。

图 4 显示使用 Olfm4 (D6Y5A) Rabbit mAb 对小鼠 Olfm4 进行免疫组织化学分析。这说明小鼠小肠的阳性染色和结肠的阴性染色，这一发现得到了蛋白质印迹的支持。图 5. 观察到的染色模式符合众多公布的正交策略，包括原位杂交。^1,2

图 4

使用 Olfm4 (D6Y5A) 对石蜡包埋的正常小鼠小肠 （左图）和结肠 （右图）细胞进行免疫组织化学分析。

图 5

使用 Olfm4 (D6Y5A)（上图）和 β-Actin (D6A8)（下图），对小鼠小肠 （阳性）、小鼠脾脏 （阳性）和小鼠结肠 （阴性）细胞的提取物进行蛋白质印迹分析。

正交策略成功的决定性标准是已知或预测的生物学作用与目的基因/蛋白质的定位以及所得抗体染色之间一致。这突出了验证模型和应用（将在下游实验中使用）中所有试剂的特异性和功能性的重要性。

像本手册中描述的其他策略一样，任何一种单独的验证策略无法单独充分验证。尽管正交策略提供了抗体表现出预期的证据，但将正交试验与其他验证方法结合起来以确保对抗体性能的信心至关重要。

 

参考文献

1. Flier, L. G. V. D., Gijn, M. E. V., Hatzis, P., Kujala, P., Haegebarth, A., Stange, D. E., 〜 Clevers, H. (2009). Transcription Factor Achaete Scute-Like 2 Controls Intestinal Stem Cell Fate. Cell, 136(5), 903–912. doi: 10.1016/j.cell.2009.01.031

2. Flier, L. G. V. D., Haegebarth, A., Stange, D. E., Wetering, M. V. D., & Clevers, H. (2009). OLFM4 Is a Robust Marker for Stem Cells in Human Intestine and Marks a Subset of Colorectal Cancer Cells. Gastroenterology, 137(1), 15–17. doi: 10.1053/j.gastro.2009.05.035

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