新型冠状病毒(2019-nCoV)双荧光qRT-PCR试剂盒使用说明

来源: 上海雅吉生物科技有限公司   2021-1-14   访问量:2365评论(0)

1.需要用户自己准备的耗材、仪器和试剂
a.具有FAM和VIC荧光通道的荧光定量PCR仪。
b.DNase-free、RNase-free的吸头、离心管、荧光定量PCR用96孔板或384孔板、PCR板封板膜。
c.生物安全柜。
d.RNA提取试剂盒。
2.样本准备
a.本试剂盒适用样本类型:上呼吸道标本(包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、深*痰液);下呼吸道标本(包括呼吸道抽取物、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、肺组织活检标本);组织培养物等样本。
b.样本采集具体方法请参考“2019新型冠状病毒核酸检测专家共识”和“新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南”。
c.样本采集后,可保存在病毒样品常规保存液进行病毒的保存,并须当日完成检测。否则按下述方案保存:2~8℃保存,不超过24小时;-20℃保存,不超过3个月;-70℃以下可长期保存,但应避免反复冻融。也可以使用病毒RNA稳定保存液进行保存,室温可以保存7天左右。
d.将样品按照病毒RNA提取试剂盒中相应的要求和步骤进行RNA提取,提取的RNA可直接用于检测。若提取后不立即检测,也可保存于-70℃备用,同时应尽量避免反复冻融。
e.经假病毒模拟验证,本试剂盒也适用于保存于常规病毒保存液中的咽拭子、唾液等样品的直接检测,无须进行RNA的抽提。但实际操作时,须根据病毒样本的来源、保存液类型进行一定的对比测试。对于保存在病毒RNA稳定保存液的样品,必须进行RNA抽提后才能使用本试剂盒进行检测。不同数量的新冠病毒N基因慢病毒保存在含咽拭子的各种病毒保存液(TE、PBS及含FBS和抗生素的HBSS)、细胞培养液(DMEM、1640,不含FBS)、RNA病毒直接qRT-PCR保存液中,未经抽提直接使用本试剂盒进行qRT-PCR检测的效果见下表。此处的病毒量为每个PCR反应体系中病毒的IU数。从下表数据可以看出,TE、PBS及常用的细胞培养液中保存的假病毒可以直接用于本试剂盒检测,而 RNA病毒直接qRT-PCR保存液效果更佳。含有FBS的HBSS可能由于FBS的影响,Ct值会高出约2-3。

病毒保存液 TE PBS HBSS + 2% FBS + 1% PS
病毒量(IU) 400 200 100 50 400 200 100 50 400 200 100 50
Ct平均值 25.46 26.43 27.73 28.44 25.51 26.40 27.50 28.42 27.58 28.57 29.38 30.38
标准偏差 0.096 0.157 0.420 0.122 0.069 0.015 0.081 0.259 0.156 0.054 0.040 0.174

病毒保存液 DMEM 1640 BeyoDirect™ RNA病毒直接qRT-PCR保存液
病毒量(IU) 400 200 100 50 400 200 100 50 400 200 100 50
Ct平均值 24.99 25.86 26.76 28.37 25.38 25.98 27.19 28.00 24.23 25.25 26.73 27.75
标准偏差 0.035 0.187 0.562 0.090 0.100 0.277 0.203 0.084 0.118 0.180 0.129 0.232

f.核酸检测的各个步骤需要在指定区域进行,以避免交叉污染。例如样本处理、加样在样本处理区,扩增试剂准备在PCR前准备区,核酸扩增在检测区。
3.qRT-PCR反应体系的设置
a.融解并混匀反应所需的各种溶液,置于冰浴上或冰盒内。
参考下表在室温或冰浴上设置qRT-PCR反应体系(以96孔板,每孔反应体系为25µl为例)。下表中的Template RNA为样品RNA、试剂盒中提供的Negative Control或Positive Control。建议每次检测都设置阴性对照(Negative control)和阳性对照(Positive control)。

Reagent Volume
Reaction Buffer 17.5μl
Enzyme Mix 2.5μl
Template RNA* 5μl
Total Volume 25μl

*注:实际操作时,如果经验证测试可免RNA抽提而直接检测,则用RNA病毒样本直接替代Template RNA。
c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀,室温离心数秒,使液体积聚于管底。
d.将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上,开始PCR反应。
e.荧光检测通道的选择:ORF1ab基因荧光基团是VIC,可选择检测通道(Reporter)为VIC/HEX/JOE,淬灭基团(Quencher)是BHQ1,如果没有BHQ1,则选择无;N基因荧光基团是FAM,可选择检测通道为FAM,淬灭基团是TAMRA,如果没有TAMRA,则选择无。请将仪器的荧光内参设置为“None”,例如:对于ABI系列仪器,将“Passive Reference”设置为“None”。
4.qRT-PCR反应程序
本试剂盒建议采用如下的qRT-PCR程序,本程序是以ABI QuantStudio™ 6 Flex荧光定量PCR仪为例:
a.反转录:50℃ 20min
b.预变性:95℃ 2min
c.变性:95℃ 15sec
d.退火/延伸:60℃ 20sec
e.重复步骤c和步骤d,总共45个循环
f.最后使用荧光定量PCR仪提供的软件分析检测结果。
5.结果的定性判断
a.阳性对照:呈典型S型扩增曲线且Ct值≤33。
b.阴性对照:无典型S型扩增曲线或Ct值>38。
c.阳性:如果待测样本检测结果VIC通道和FAM通道均Ct值≤35,则可判断为新冠状病毒(2019-nCoV)核酸阳性。
d.阴性:如果两个通道检测Ct值无数值或Ct值>38,且阳性对照品检测结果为阳性,此次结果判断为新冠状病毒(2019-nCoV)核酸阴性,但不排除其它冠状病毒感染的可能。
e.可疑:如果待测样本3538,则判断为新冠状病毒(2019-nCoV)核酸阴性;如其中任一通道35



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