一夫当关,莫如双管齐下——聚焦热启动Taq DNA聚合酶双封闭抗体

来源: 上海翊圣生物科技有限公司   2020-10-9   访问量:876评论(0)

一夫当关,莫如双管齐下

——聚焦热启动Taq DNA聚合酶双封闭抗体

当下基于PCR技术的核酸检测仍有其应用难点

难点检测试剂的稳定性

核酸检测行业人都格外关注检测试剂的稳定性,不管是长期储存稳定性还是短期偏离正常保存条件的稳定性,都直接影响检测结果的有效性。而短期偏离正常保存条件的稳定性在实际使用和运输过程中尤为重要,比如遇到样本量大、适配自动化、排队等待上机等情况,反应体系需要在室温或4℃放置,再比如遇到运输时间长,温度难以控制,检测体系就暴露在风险之下。如何保证稳定性,如何确保检测结果有效、可信,是行业关注的难点。

难点非特异性扩增

非特异性扩增直接影响检测结果的判读,还消耗反应体系中的引物等物料,导致目的基因扩增失败。试剂开发人员通过优化引物、调整镁离子浓度和酶量、调整退火温度等方法避免非特异性扩增,但仍需谨慎操作,稍不留意也会导致检测失败。

热启动DNA聚合酶可帮助攻克核酸检测应用难点

目前常用抗体法热启动Taq DNA聚合酶帮助提升试剂稳定性和解决非特异性扩增问题。传统的抗体法热启动,是利用Taq DNA聚合酶抗体封闭其5'→3'聚合酶活性,防止在低温时错配或引物二聚体引起非特异性扩增,在PCR预变性95℃加热时,抗体蛋白变性,释放DNA聚合酶活性,不影响正常扩增。利用抗体封闭聚合酶活性,可谓一夫当关,万夫莫开。

一夫当关,莫如双管齐下——翊圣带来双封闭抗体

聚合酶活性封闭抗体可以有效防止错配引起的非特异性扩增,提升了全预混反应体系的稳定性,然而Taq DNA聚合酶除了具有5'→3'聚合酶活性,还有5'→3'核酸外切酶活性,这部分外切酶活性可能会在低温时导致错配探针或其它物料降解,造成非特异信号。因此翊圣开发了双封闭抗体,不仅可以封闭Taq DNA聚合酶的聚合酶活性,还能同时封闭Taq DNA聚合酶的外切酶活性,双管齐下,既能有效防止错配或引物二聚体引起的非特异性扩增,又能防止物料降解产生非特异信号,双重提升试剂稳定性,使检测试剂在运输或室温使用过程中都能够从容应对。

1. 传统抗体法封闭原理示意图

图中高亮部分为Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性结构域,抗体只封闭Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性

2. 翊圣双封闭抗体封闭原理示意图

图中高亮部分为Taq DNA聚合酶5'→3'聚合酶活性结构域和5'→3'核酸外切酶活性结构域,翊圣双封闭抗体含两种抗体,可同时封闭Taq DNA聚合酶的5'→3'聚合酶活性和5'→3'核酸外切酶活性

3. 双封闭抗体外切酶活性封闭效率检测

设计引物探针配于反应液中,40℃反应,检测荧光信号。

黄色为未封闭的Taq DNA聚合酶组

紫色为双封闭抗体封闭的Taq DNA聚合酶组

由图3可以看出双封闭抗体可有效封闭Taq DNA聚合酶的外切酶活性。

双封闭抗体有效提升检测试剂稳定性

用传统封闭抗体与双封闭抗体分别封闭Taq DNA聚合酶,配置成含引物探针的全预混液,在4℃或37℃放置10天或1、3、5天,扩增10000拷贝ASF基因质粒,观察扩增曲线和CT值变化,对比传统封闭抗体和双封闭抗体对全预混反应液稳定性的作用。

4. 传统封闭抗体封闭反应液扩增10000拷贝ASF基因质粒扩增曲线图

蓝色为含引物探针全预混液4℃放置10天后扩增曲线,红色为4℃放置0天对照

5. 双封闭抗体封闭反应液扩增10000拷贝ASF基因质粒扩增曲线图

蓝色为含引物探针全预混液4℃放置10天后扩增曲线,红色为4℃放置0天对照

由图4、图5可以看出,双封闭抗体比传统封闭抗体更能保持反应液稳定,有效提升检测试剂稳定性。双封闭抗体封闭含引物探针全预混液4℃放置10天扩增曲线和CT值无明显变化。

6. 传统封闭抗体封闭反应液扩增10000拷贝ASF基因质粒扩增曲线图

蓝色为含引物探针全预混液37℃放置5天后扩增曲线

绿色为含引物探针全预混液37℃放置3天后扩增曲线

黄色为含引物探针全预混液37℃放置1天后扩增曲线

红色为37℃放置0天对照

7. 双封闭抗体封闭反应液扩增10000拷贝ASF基因质粒扩增曲线图

蓝色为含引物探针全预混液37℃放置5天后扩增曲线

绿色为含引物探针全预混液37℃放置3天后扩增曲线

黄色为含引物探针全预混液37℃放置1天后扩增曲线

红色为37℃放置0天对照

由图6、图7可以看出,双封闭抗体比传统封闭抗体更能保持反应液稳定,有效提升检测试剂稳定性。双封闭抗体封闭含引物探针全预混液37℃放置1、3、5天CT值差小于0.2。

双封闭抗体帮助解决基线上漂问题

某些引物配合特定buffer和仪器时,会出现基线上漂的情况。翊圣尝试多种方法改善基线问题,发现双封闭抗体更有利于基线平稳。

8. N基因扩增曲线图

红色为传统封闭抗体封闭反应液扩增曲线

绿色为双封闭抗体封闭反应液扩增曲线

9. ACT基因扩增曲线图

红色为传统封闭抗体封闭反应液扩增曲线

绿色为双封闭抗体封闭反应液扩增曲线

由图8、图9可以看出特定引物和buffer下,使用双封闭抗体可帮助解决基线上漂问题。

使用双封闭抗体获得良好线性

用双封闭抗体封闭的反应液扩增100000、10000、1000、100拷贝ASF/ACT双质粒,制作标准曲线。

10. 双封闭反应液制作ASF基因标准曲线图

ASF基因标准曲线R20.998,扩增效率98.848%,线性良好,无非特异性扩增。

11. 双封闭反应液制作ACT基因标准曲线图

ACT基因标准曲线R20.998,扩增效率98.113%,线性良好,无非特异性扩增。

翊圣生物提供高品质核酸检测试剂原料

翊圣生物十年匠心,专注于分子工具酶原料的生产和开发。翊圣生物凭借自身成熟抗体筛选平台Taq DNA聚合酶为靶标分子进行封闭抗体的筛选经过多年的潜心研究与体系优化开发出热启动Taq DNA聚合酶双封闭抗体验证可封闭多种Taq DNA聚合酶突变体,目前已有克级现货库存,助力核酸检测应用。

产品信息

产品名称

产品编号

规格

Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody

31303ES60

100 µg

Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody

31303ES80

1 mg

Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody

31303ES90

5 mg

Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody

31303ES92

10 mg

Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody

31303ES93

100 mg

Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody

31303ES94

1000 mg

关于翊圣生物

上海翊圣生物科技有限公司(Yeasen Biotech Co., Ltd)成立于2009年,长期专注于分子酶原料及建库试剂盒等产品的研发和生产。

我们的目标让下游企业节省更多的成本,为中国精准医疗的发展贡献自己的力量。

翊圣生物拥有先进的分子酶双向技术平台、大规模蛋白发酵纯化技术平台、高效抗体筛选技术平台,目前已成功开发各类诊断分子酶、二代测序建库酶等40余种,并实现工业放大。翊圣生物开发的PCR类、NGS类、体外诊断(IVD)和相关酶原料等产品获得了广大客户的认可。此外,我们还为工业客户提供定制化开发服务,以满足个性化需求。

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