一文教你如何避开AAV实验中的那些雷区

来源: 上海吉凯基因化学技术有限公司   2020-8-11   访问量:1296评论(0)


腺相关病毒(adenovirus associated virus,AAV)作为一种安全高效的基因表达递送病毒载体,近年来受到广大科研人员的追捧。然而AAV使用过程中决定实验成败的因素较多,有时不注意就会遇到这样那样的bug。本文给大家总结了AAV使用中常见的雷区,希望大家在实验中加以注意,取得理想的实验结果。


雷区一:AAV的保存与分装

正确的保存AAV确保其质量是取得良好实验结果最基本的前提,看似简单的事情也曾让不少人付出惨痛代价。常见的如病毒放在4℃冰箱后忘记收到-80℃冰箱,或不管用量多少都整管取出导致反复冻融,再有分装时未在无菌条件下操作导致病毒污染,还有分装体积过小致使病毒损失严重等等。


因此,在使用AAV时应注意以下几点:

1. 收到病毒后立即置于-80℃保存,勿放于4℃,如需分装,则分装后的病毒也要放在-80℃;

2. 初次使用时可根据每次病毒用量进行合理的分装,不过分装最小体积不宜小于10 μl(吉凯基因AAV产品均已分装为50μl/管,除用量极少的情况下,一般无需再次分装)

3. 病毒分装或一次不能用完时,一定要确保无菌操作,保证病毒的纯净状态;

4. 病毒当天未用完但明天会接着用,可直接4℃保存过夜,因为-80℃保存会增加冻融次数严重影响AAV滴度;

5. AAV需要稀释后使用时,按需稀释,稀释后的病毒需一次性用完,不要再冻存于-80℃。


雷区二:血清型的选择

腺相关病毒感染细胞是通过其衣壳蛋白与细胞表面的受体蛋白相结合进而经胞饮作用进入细胞体内,不同的血清型具有不同的衣壳蛋白空间结构,其识别的细胞表面受体也不同,因此不同血清型对细胞或组织的亲和力不同。所以一旦选择的血清型对目标细胞或组织亲和力较差,很难实现较好的感染效果。


为了帮助大家跨过这个雷区,吉凯基因技术团队通过分析大量使用AAV的高分文章案例并亲自对比验证,总结出了研究不同组织器官时血清型选择推荐表(表1),根据感染目标组织,血清型选择一目了然。


表1. 常见组织器官推荐血清型

组织血清型(标红的为推荐)
心脏AAV9、AAV6、AAV1
AAV9、AAV8、DJ、 AAV2
AAV6AAV9(肺泡)、AAV5、AAV1、AAV2、DJ
肌肉AAV9、AAV8、AAV7、AAV2(慢纤维)、AAV6(快纤维
神经PHP.eB、AAV9、AAV-retro(逆行)、AAV1(顺行)、AAV2、AAV4、AAV8、AAV5
AAV9、AAV2、AAV8、DJ
脂肪AAV9、DJ、AAV1
AAV8、AAV2、AAV5、AAV1
胰腺AAV9、AAV8
眼睛AAV2、AAV1、AAV5



此外考虑到有些老师的研究新颖,目标组织尚未有相关案例报道,吉凯基因也推出了彩虹装,通过给不同小鼠注射不同血清型的AAV,三周后取材观察感染效果,直观的对比出最适血清型。


表2. 吉凯基因AAV彩虹装

彩虹装血清型提供量
眼/其他器官1/2/5/6/8/9/DJ10 μL/种血清型
神经系统*1/9/Retro/PHP.eB10 μL/种血清型
肝脏/肾脏2/8/9/DJ100μL/种血清型
心脏/血管/肌肉1/6/8/9100 μL/种血清型



雷区三:注射方法及剂量选择

使用AAV时,在这里常犯的错误主要有两个:

1. 注射方法选择不合适,理论上尾静脉注射后AAV会进入血液循环而到达全身各处,因此不少人不管感染什么组织都选择尾静脉注射(操作简单嘛),然而实际上很多组织虽然通过尾静脉注射的方法可以感染上,但是很难达到很好的感染效果,比如骨关节、鼻腔、瘤体组织、肺等。


2. 注射剂量选择不合适,许多人注射AAV时喜欢直接将文献中的注射方法和剂量拿过来用(尤其现在实验被疫情耽搁那么久,相信不少人为赶进度选择直接用文献中参数,不建议这么做!),这种方法看似稳妥实则埋雷无数,因为不同实验室操作手法、注射体积、动物背景等的差异,往往导致AAV注射剂量存在差异。比如同样是尾静脉注射AAV感染成年小鼠肝脏,相同的剂量用100 μl体系注射的效果就明显不如200 μl体系 。


针对以上常犯错误,我们总结了感染不同组织器官时推荐的注射方法以及注射剂量范围(如表3所示),建议大家以此为参考,在正式实验之前设置至少三组浓度梯度进行预实验,确定最适的AAV注射剂量。


表3.小鼠不同组织器官常用病毒

注射方法及剂量

组织器官常用注射方法推荐剂(vg)推荐体积
心脏、肝脏、肾脏、胰腺等尾静脉注射≥1.0E+11100~200 μl
心脏、肝脏、肾脏、胰腺等脏器原位注射0.5-5.0E+101.5~3 μl/位点,多位点注射
肝脏、胰腺、肠道、肌肉等腹腔注射1.0-5.0E+1150~100 μl
气管、肺气管内注射0.5-5.0E+1150~100 μl
局部血管血管夹闭注射~1.0E+10~100 μl
瘤体组织瘤内注射0.5-5.0E+113~5 μl/位点,多次注射
关节软骨组织关节腔注射1.0-5.0E+105-10 μl
全脑及不同脑区脑立体定位注射1.0-10.0E+90.5-1.5 μl/位点
脊髓脊髓原位注射1.0-10.0E+9多位点注射,0.5 μl/位点
眼原位注射~5.0E+91.0~2.0 μl


注意,有些器官有多重注射方式可选,采用系统注射的方法操作简单,但是用量大;采用原位注射的方法用量小、感染效率高,但是操作难度大、创伤大。可根据后续实验要求及预算来做出选择。


吉凯基因拥有强大的博士技术团队,给您提供全方位的病毒设计及使用指导服务,让您的病毒实验只有服务区没有雷区!

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