TF/TQ染料标记MMP和酪蛋白的肽序列及结果

来源: 西安百萤生物科技有限公司   2020-7-6   访问量:1493评论(0)

TF/TQ染料标记MMP和酪蛋白的肽序列及结果

材料和方法


所有肽均采用美国肽公司标准FMOC化学合成。一些TF肽是用FMOC-Lys(TF)-OH、FMOC-Asp(TF)-OH或FMOC-Glu(TF)-OH氨基酸制备的。在肽的标记中,用TF-NHS酯标记赖氨酸残基的N端氨基或ε-氨基。用TF马来酰亚胺或碘代乙酰胺标记巯基半胱氨酸残基。

TF1,TF2,TF3,TF4,TF5,TF6,TF7和TF8的酸、马来酰亚胺和NHS酯形式,以及FMOC-Lys(TF2-Boc)-OHFMOC-Lys(TF3)-OHFMOC-Asp(TF3)-OHFMOC-Glu(TF3)-OH等均可从百萤生物获得。

所有的酶分析都是用从Sigma,R&D Systems,EMD Chemicals购买的纯化酶完成的。使用用日立U-3010拍摄了吸收光谱,终点荧光分析在BMG NovoStar或Gemini SpectraMax(分子设备)上进行,酶动力学分析在FlexStation分子设备上进行)。


Tide Fluor (TF)染料的光谱特性


我们的TF系列荧光标记染料覆盖了整个可见光谱,具有非常高的标记效率。例如,TF2的光谱特性与AF 488、FAM和FITC基本相同。在生理条件下或细胞内,它比荧光素亮3倍,耐光性高4倍。TF染料具有对pH4~pH10的pH波动不敏感的荧光,而FAM和FITC的荧光强度在同一范围内强烈依赖于pH值。

TF 染料Ex(nm)Em(nm)可替代
TF1353 nm442 nmAF350, AMCA, EDANS
TF2498 nm520 nmAF488; DL488, FITC, FAM, Cy2
TF3560 nm575 nmAF546, AF555, Cy3, DL549, TAMRA
TF4585 nm605 nmAF594, DL594, Texas Red®, ROX
TF5650 nm670 nmAF633, AF647, DL633, DL649, Cy5
TF6685 nm700 nmAF680, DL680, Cy5.5
TF7755 nm780 nmAF750, DL750, Cy7
TF8785 nm800 nmDL800, IRDye CW800


使用TF标记的FRET底物检测基质金属蛋白酶(MMP)活性


基质金属蛋白酶(MMPs)参与细胞外基质成分的降解,在细胞凋亡、胚胎发育、生殖组织重塑和修复中起重要作用。 百萤为大家筛选了以下基于TF的FRET底物,以检测MMP活性。

#Sub肽序列ExEm
1TQ2-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaDab(5-FAM)-Ala-Lys-NH2492 nm514 nm
2TQ2-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaDab(TF2)-Ala-Lys-NH2495 nm520 nm
3TQ3-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF3)-Ala-Lys-NH2560 nm575 nm
4TQ4-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF4)-Ala-Lys-NH2585 nm605 nm
5TQ5-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(FT5)-Ala-Lys-NH2650 nm670 nm
6TQ6-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(FT6)-Ala-Lys-NH2685 nm700 nm
7TQ7-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF7)-Ala-Lys-NH2755 nm780 nm
8TQ8-Gaba-Pro-Cha-Abu-Smc-His-AlaLys(TF8)-Ala-Lys-NH2785 nm800 nm


MMP活性的检测(续)

图1.以TF为基础的MMP底物与MMP-1(50units/ml)在室温下孵育15分钟。所有基质在5 uM的温度下使用,使用Sub#2的反应速度设定为100%。用上表中分别列出的激发波长和发射波长测量荧光强度。


用TF标记酪蛋白底物检测通用蛋白酶活性


对各种蛋白酶活性的检测已成为许多生物实验室的常规任务。TF染料标记的酪蛋白缀合物被证明是广泛的蛋白酶的通用底物。在完整的底物中,酪蛋白被TF染料大量标记,导致了荧光猝灭。蛋白酶催化水解减轻了它的淬灭效应,产生荧光性很强的TF染料标记的肽段。TF染料标记肽荧光强度的增加与蛋白酶活性成正比。

#Sub肽底物Ex/Em相对Kcat/Km
1TF1-Casein (~6 Dyes/Casein)492/514 nm98%
2TF2-Casein (~6 Dyes/Casein)495/520 nm92%
3TF3-Casein (~6 Dyes/Casein)560/575 nm100%
4TF4-Casein (~5 Dyes/Casein)585/605 nm73%
5TF5-Casein (~5 Dyes/Casein)650/670 nm81%
6TF6-Casein (~4 Dyes/Casein)685/700 nm76%
7TF7-Casein (~4 Dyes/Casein)755/780 nm56%
8TF8-Casein (~4 Dyes/Casein)785/800 nm43%

图2. #3底物胰蛋白酶的蛋白水解裂解图。 在室温下将3号底物与胰蛋白酶一起孵育。对照孔仅具有蛋白酶底物,而没有胰蛋白酶。 使用FlexStation从时间0(添加胰蛋白酶时)开始检测荧光信号。


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