不带MALS的HPLC,你还在让蛋白聚体分析裸奔吗?

来源: 北京百普赛斯生物科技有限公司   2020-4-3   访问量:1272评论(0)

作为抗体药物开发的关键试剂,重组蛋白抗原贯穿抗体药物研发的前期免疫、抗体筛选和鉴定、抗体药物候选物体内体外功能验证、抗体药物质量控制以及临床样本分析等过程,而重组蛋白的质量和活性一定程度上直接决定了抗体药物研发的成败和周期。

重组蛋白抗原需要尽可能保持和天然蛋白一致的正确折叠和构象,从而保证蛋白抗原的天然活性,同时具有最小的批间性能差异,帮助提高药物开发成功率。

蛋白结构决定活性和功能

蛋白质的结构决定其功能和活性,而重组蛋白在溶液中的聚集状态、二硫键的正确配对与否,翻译后修饰等理化性质是蛋白正确结构的基础,在重组蛋白产品的设计、表达和生产过程中应该严格加以控制。

蛋白在溶液中的聚集状态,是保证蛋白正确结构的重要基础性质之一,需要重点关注。天然蛋白在体内往往以一定的天然聚集状态和构象的形式存在,发挥其正确的生物学功能,而重组蛋白在生产过程中产生的随机不正确聚集常常会引起某些关键功能表位构象或暴露程度的改变,导致无法获得针对天然有效表位的高质量抗体候选物,影响抗体药物体外功能验证等结果,显著降低抗体药物开发的成功率。

举例来说,天然的FGL1蛋白以共价二聚体形式存在,N端的Cys26会形成一对肽链间二硫键帮助其维持正确的稳定结构。重组FGL1表达生产过程中,如果人为去除Cys26,FGL1的表达量会明显提高,但FGL1将无法形成共价二聚体,对所得到的FGL1蛋白的功能产生较大影响。

ACROBiosystems生产的FGL1蛋白保留了Cys26,最大程度维持其天然构象不变,可形成正确的链间二硫键,经BLI测定,FGL1和LAG-3亲和力常数为13.6nM(图1. a),与文献报道的28nM非常接近[1];而人为去除链间二硫键的FGL1蛋白和LAG-3的亲和力常数仅为0.27μM(图1. b),比文献报道偏低10倍。且去除二硫键的FGL1蛋白的聚集状态、稳定性等各方面性质和天然二聚体FGL1蛋白有明显差异(data not shown)。因此,人为引入的蛋白结构变化会显著增加抗体药物开发的不确定性。

图1. 不同FGL1蛋白和LAG-3的BLI亲和力分析

蛋白在正确的聚体结构下才能有效激活下游通路,发挥其生理功能。比如,在调控免疫应答过程中发挥重要作用的TNF超家族,该系列蛋白在天然状态下为三聚体结构,只有三聚体形式TNF-α与TNFR1的胞外区结合,才能引起TNFR1的三聚化,进而有效的激发下游通路(图2)引起细胞凋亡[2]。使用具有天然三聚体结构的蛋白免疫得到的抗体,在体内将能更好的识别天然抗原表位,有效的阻断受体和配体的结合,达到预期的治疗效果。

图2. TNF-α与TNFR1的胞外区结合引起细胞凋亡的机制

可见,蛋白质的聚集状态是决定其功能和活性的重要性质之一,应在重组蛋白抗原产品的设计、表达和生产过程中重点关注并严格加以控制,这就要求采用较为准确可靠的分子量测定分析技术来表征重组蛋白在溶液生理条件下的真实聚集状态,指导重组蛋白抗原产品的研发设计、生产工艺优化和质量控制。

蛋白分子量分析技术:SEC-HPLC和MALS

蛋白分子量分析技术主要有:

1)基于SEC-HPLC(高效分子筛液相色谱)的保留时间内插估算法;

2)基于SEC-MALS(多角度激光散射)的分子量绝对定量法

两种技术在原理上有一些异同点,如下表:

两种技术均用到了SEC(Size Exclusion Chromatography, 体积排阻色谱)技术,SEC技术原理是蛋白样品流经多孔的惰性色谱柱基质时对样品进行分离,较小的分子进入填料孔内,滞留时间长,较大的分子被排阻在孔外可以随流动相快速地通过色谱柱(图3),因此可以利用分子筛对分子量大小不同的抗原蛋白进行分离。由于聚集形成不同大小的聚体,可利用分子筛对分子量大小不同的各组分而完成分离。

图3. SEC技术工作原理

SEC-HPLC通常是先测定一系列已知分子量的球蛋白标准品(如Thyroglobulin,IgG, BSA等)的洗脱保留时间TR ,然后生成分子量计算标准曲线 (Log MW ~TR),用于蛋白分子量的测定。实验中只要将待测蛋白的保留时间代入上述标准曲线,就可以快速计算得到分子量。但这种方法存在很多问题和局限性,比如实际实验中测定得到的分子量往往和真实值相去甚远,极大地影响了结果的判断。这是因为SEC的基本原理是假定不同蛋白形状一致,蛋白和填料之间没有任何相互作用,蛋白洗脱体积只与SEC排阻性质有关,且洗脱体积可稳定重现。实际上,不同的蛋白具有不同的结构和形状,相同分子量的不同蛋白在SEC排阻中性质往往不尽相同;不同蛋白表面疏水性存在差异,也会引起蛋白和柱子填料之间的非特异作用;另外柱子性能的变化、流动相的成分等也会显著影响洗脱保留时间。这些因素导致SEC-HPLC测定结果和真实值存在较大差异,无法满足准确测定蛋白分子量和聚集状态的要求。

MALS技术(Multi-Angle Light Scattering)是基于蛋白的分子量与光散射的强度直接相关来测定蛋白绝对分子量的技术,无需使用标准蛋白,不依赖于洗脱保留时间,也就避免了SEC分子筛测定分子量的诸多问题[3]。SEC-MALS技术中,通过SEC分离后的各组分进入多角光散射检测器,激光照射到分析物时会发生光的散射,MALS通过多个角度同时测定散射光的强度(图4.a)。,从公式b1中(图4.b1)可以看出散射光强度正比于摩尔质量、浓度、折光指数增量的平方,用公式b2(图4.b2)可以直接计算出分析物的绝对分子量[4]。由此可见,MALS技术不依赖于蛋白的洗脱保留时间来计算蛋白分子量,因此测定结果较传统的SEC-HPLC更加准确可靠。

我们用SEC-HPLC和MALS两种方法分别测定了OKT3、赫赛汀(Herceptin)和伊匹单抗(Ipilimumab)三种已知分子量的上市抗体药物。如表1所示,三种抗体药物实际具有非常接近的分子量(150-160kDa),但三者洗脱保留时间却有较大的差异,造成SEC-HPLC计算分子量大相径庭,其中OKT3抗体测定为212.5kDa,Ipilimumab仅为66.3kDa,和真实分子量相去甚远。而SEC-MALS检测三种抗体分子量和抗体理论分子量非常接近(图5-6)。

表1 三种抗体药分子量测定结果

图5. 不同抗体的SEC-HPLC分子量测定结果

图6. SEC-MALS测定三种抗体药物的分子量.a OKT3, b Herceptin, c Ipilimumab

可见,由于SEC-HPLC分子筛技术测定分子量对保留时间严重依赖,使用标准蛋白marker对比无法准确测定溶液中蛋白分子量和聚集状态,成为高质量重组蛋白生产开发的限制因素。而SEC-MALS技术直接准确测定蛋白绝对分子量,不依赖于保留时间和marker,成为高质量重组蛋白生产开发和质量控制的必备技术手段。

经MALS验证的TNF超家族三聚体活性蛋白

作为药物开发用重组蛋白的行业工作者,ACROBiosystems针对抗体药物开发的需求,使用SEC-MALS技术准确测定溶液中生理条件下蛋白分子量和聚集形式,推出新一代经过MALS分子量验证的TNF超家族三聚体蛋白系列产品,具有更接近天然的折叠构象和正确的三聚体聚集状态,产品性质更均一,批间差更小,活性经过ELISA、流式细胞,功能等应用场景的验证,加速抗体药物的开发。

以CD27 Ligand为例,CD27L属于TNF超家族,主要表达于活化的T细胞、B细胞及成熟的DC细胞中,CD27L体内以天然三聚体形式存在,通过和其受体CD27之间的相互作用,促进T细胞和B细胞的活化、增殖及分化,在调控免疫应答过程中发挥重要的作用,是一种很有潜力的肿瘤生物治疗靶点。

我们验证了不同来源的CD27L重组蛋白的HPLC均一性、MALS分子量和活性。如表2所示,ACRObiosystems开发的CD27L(MALS verified)三聚体蛋白用SEC-HPLC上测定为均一的单峰,主峰纯度达到86%以上,经MALS测定分子量为180.8kDa,确定为均一的天然三聚体。而其他两个来源的蛋白,HPLC测定显示均一性较差,产品中都含有聚集程度不一的不同组分,分别为347kDa的异常高聚体(含量69.7%)和含有多种不同聚集体的不均一混合物(图7)。ELISA检测CD27L和受体CD27的结合性质,ACRObiosystems生产的重组CD27 Ligand (MALS verified)蛋白和其配体CD27结合活性远远好于其他同类产品(图8)。

图7. 不同来源CD27L重组蛋白的MALS比较

图8.不同来源CD27L蛋白的ELISA结合活性比较

表2. 不同来源重组CD27L Fc蛋白的性质比较

此外,ACRO还针对ELISA和流式细胞分析等实验场景,开发了生物素标记的三聚体产品系列,经过细胞功能活性验证(图9)。同时免费提供实验验证protocol,进一步加速抗体药物的开发。

图9. a.CD27 Ligand(His Avi tag)蛋白的纯度和分子量验证,CD27L经SEC-HPLC测定其纯度>90%,均一组分,MALS经分子量验证为68.9kDa的三聚体. b.流式细胞实验验证.

结论

1. 蛋白质的结构决定其功能和活性,药物开发用重组蛋白抗原应尽可能保持和天然蛋白一致的正确折叠和构象,从而保证蛋白抗原的天然活性。一般不建议人为改变重组蛋白的结构,避免给药物的开发引入新的不确定性。

2. 蛋白的聚集状态是决定其功能和活性的重要性质之一,在重组蛋白产品的设计、表达和生产过程中应该严格加以控制。

3. 传统的SEC-HPLC技术因其自身诸多局限性,无法准确测定蛋白质分子量,给高质量药物开发用重组蛋白的开发和质量控制带来挑战,影响了抗体药物的开发。SEC-MALS技术具有准确度高,无需标准蛋白,不依赖于洗脱保留时间等优势和特点,可以对蛋白绝对分子量进行直接准确测定,避免了SEC-HPLC的问题和局限。

4. ACRO新推出的MALS验证的TNF超家族三聚体蛋白系列产品,经MALS验证在溶液生理条件下具有正确的三聚体存在形式,更接近蛋白的天然构象,从而具有正确的蛋白功能活性。同时产品更均一,批间差更小,根本上避免了随机高聚引起的批间差异大、亲和效应和非特异背景信号等常见问题。

5. 作为药物开发用重组蛋白抗原的行业引领者,ACRO基于对抗体药物开发过程的深入理解,针对不同应用场景的需求来进行蛋白的产品开发和设计,最大程度减少随意的人为结构干预,尽可能保持蛋白的天然状态和构象,产品经过ELISA、流式细胞、功能实验等多个维度不同分析应用场景的全面验证,有助于降低抗体药物开发的难度和不确定性。

经MALS验证具有正确聚体结构的蛋白产品

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参考文献:

[1] Wang, et al, Fibrinogen-like Protein 1 Is a Major Immune Inhibitory Ligand of LAG-3. Cell. 2019.

[2] Harper et al . Induction of TNF Receptor I-Mediated Apoptosis via Two Sequential Signaling Complexes. Cell. 2003.

[3] Paula et al. A Review Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2012.

[4] Some et al. Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS). Journal of Visualized Experiments. 2019.



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