这样做,发文章更顺利!最全的实验细胞注意事项

来源: 上海吉凯基因化学技术有限公司   2020-1-17   访问量:3340评论(0)

细胞系在生物科学中被广泛使用,它们无限增殖的能力意味着,从理论上讲,科学家们可以精确地复制以前的研究重现实验结果或者在此结果基础上做更深入的研究。但是细胞系被贴错标签或处理不当会导致有问题的细胞系的错误识别,污染和/或传播,进而可能影响研究数据的有效性和准确性。
2017年10月12日来自荷兰内梅亨大学的Willem Halffman和Serge Horbach在PLoS ONE期刊上发表题为“The ghosts of HeLa:How cell line misidentification contaminates the scientific literature”的研究,发现3万多篇论文使用了HeLa细胞交叉污染的错误细胞系导致研究结果无效。

文章作者Horbach说,“大多数科学家都不是故意地发表关于错误的细胞的发现。这是一个诚实的错误。只是令人担忧的问题是这些研究数据是潜在无效的,而且是不可能重复的。更可怕的是,我们半个世纪前就已知道这些错误标识的细胞,然而很多研究人员并没有意识到这一点。每周都会有新的关于错误标识的细胞的论文发表。”

科学研究中所用细胞系的真实性验证是基础而且必要的。真实性验证能够确保细胞没有鉴定错误、没有交叉污染、遗传上与起始保存样品没有差异。那在科学研究工作中应该如何选择所需要的细胞?如何获取实验所需细胞?所选用的或得到的细胞可靠性如何?如何判断?这些问题对于需要使用细胞进行研究工作的科研人员是必须首先解决的问题。希望大家能在接下来的内容中找到答案。

一、细胞来源
细胞系可以1)直接从各种正常组织直接取材,进行原代培养,2)可以从其他实验室获得,3)也可以从细胞库购买。无论采用何种来源,都必须确保对细胞进行身份验证,并且没有污染,例如支原体。那不同来源的细胞需要注意哪些问题呢?
1、直接取材,进行原代培养获得
从新鲜组织中衍生出一种新的细胞系,特别是人类细胞,是一项昂贵且费时的工作。新细胞系的后续价值将取决于验证其来源的能力以及相关的可用信息。这些信息包括细胞来源组织,临床资料,其他相关信息。
(1)细胞来源组织:首先需要获得捐助者或患者的同意和/或道德审查许可。另外,要记录组织来源,进行组织病理学验证,与正常组织进行比较。
(a)将用于原代培养的一小部分样品(或血液样品或来自供体的DNA)立即冷冻或处理。然后可以使用组织或DNA明确证明该细胞系源自推定的供体。尽管基因型(核型,拷贝数变异(CNV)作图分析,甚至全基因组序列)的其他信息有时会有助于确保身份,但建议采用短串联重复序列(STR)进行身份验证
(b)最理想的情况是,用于组织病理学验证的组织最好由同一组织病理学家报告手术标本。如果患者样本由临床医生直接提供给实验室,则此步骤特别重要,因为它可能无法代表发送给组织病理学家的手术样本。例如,它可能距肿瘤一定距离并因此缺乏癌细胞,或者可能来自不受遗传或表观遗传缺陷引起的特定病理学影响的区域。
(c)少量血液(例如10毫升)或正常组织应冷冻。该组织以后可用于寻找遗传差异,也可用于身份验证。对于iPSC品系,或当使用直接重编程从一种衍生出另一种体细胞类型时,冷冻保存所用原始细胞的储备液也是一种好习惯。这些对于使用新的重编程技术衍生出其他细胞系可能很重要,而且对于提供原始供体材料以验证使用该细胞系的后来发现也可能很重要。如果使用体细胞核移植(SCNT)或克隆技术来衍生细胞系,例如ES细胞,则应分别保留来自体细胞供体和卵母细胞供体的细胞或组织,以匹配核和线粒体DNA。

(2)临床资料:如果捐赠者或患者表示同意并经过道德审查,则应尽可能多地记录和存储以下尽可能多的信息。用于明确识别捐赠者的信息(包括姓名,医院编号,地址和出生日期)应以更高的安全性存储,最好与其他数据分开存储。在英国,需要NHS合同或名誉合同来获得患者详细信息,并且此类信息切勿与未经授权的同事共享或发布到公共领域。
(a)供体/患者的年龄和性别
(b)医院和病理编号
(c)组织标本的起源部位和性质
(d)癌症或其他综合症或病理的阶段和等级
(e)组织病理学报告的副本
(f)临床病史包括治疗
(g)其他信息,例如肿瘤标记物状态,遗传信息和家庭数据等
(h)捐助者的知情同意和放弃商业权利的证据

(3)其他相关信息:关于该细胞系的起源和派生保留的信息越多,该细胞系对始发者和任何后续用户有用的可能性就越大。这些信息包括:所有培养基和添加剂的类型,来源和批号以及建立细胞系的方法;使用抗生素情况,支原体检测情况;细胞系是否经过基因修饰;对于iPSC或通过直接重编程衍生的细胞系,应描述所用方法,包括所用基因和载体等等。

2、从其他实验室获得
从其他实验获得细胞这种途径存在许多潜在的危害。细胞系可能根本不是他们声称的那样,并且不能保证它仍然是同一细胞系或具有与已发布描述的相同属性。如果接收实验室希望依靠通过细胞系获得的历史数据,则在接受进入的细胞系用于一般用途之前,应进行验证
在收到细胞细后,同时在在冻存之前,应使用已经批准的基于DNA的方法进行细胞系鉴定,以确认细胞系的起源并检查错误识别。对照国际细胞系认证委员会(ICLAC)错误识别的细胞系数据库来检查细胞系名称。在将新的细胞系存入液氮时应重新用STR对细胞身份进行验证。人类细胞系可能携带病原体,包括病毒污染,对实验室工作人员构成潜在的健康危害。它们还可能被细菌,真菌,支原体或病毒污染,并可能扩散到其他细胞系。如果要将这些细胞用于动物,必须对它们进行测试并证明不含相关病原体,这一点也很重要。否则这些病原体可能会对动物或者照顾动物的科研人员带来危害。
新细胞系应在实验室和储存中进行隔离,直到对它们的来源进行鉴定,并证明它们不含微生物。最佳方法是拥有II级微生物安全柜(MSC)和专用于隔离区的培养箱。如果无法做到这一点,则应采取其他步骤以最大程度地减少污染扩散的风险,其中包括(a)仅当当天所有其他细胞培养完成后才对新细胞系进行处理,(b)在进入普通培养箱之前,应应将新的培养物放置在专用培养箱中或密封容器中;(c)使用后,应使用合适的非腐蚀性消毒剂清洁MSC,并在关闭前再运行至少5分钟。
用户还应确认他们获得的细胞系适合于他们自己的特定目的。即使显示出细胞系是真实的,它也可能会随着传代时间的延长而失去特定的关键特征。 核型分析是一种简单的测试,可以揭示细胞系的变化。在开始工作之前确认适当的特性可以节省大量的时间和精力。

3、从细胞库购买
学术机构或商业机构已经建立了许多保藏中心或细胞库。这些来源的细胞系已经进行了验证,并鉴定其在培养物中常见的污染微生物,因此除非随附信息中另有说明,否则它们不太可能被污染或错误识别。但是,其中一些细胞系是在实验室之间多次转移后获得的,因此,除非在分析证书中明确说明,否则不能保证真实性和不受微生物污染的影响。这些保藏中心或者细胞库会对其细胞系进行常规验证,并为细胞系提供分析证书,包括STR分型报告。

细胞库网址
American Type Culture Collection (ATCC)www.atcc.org
National Infrastructure of Cell Line Resourcehttp://www.cellresource.cn/
中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库http://www.cellbank.org.cn/
CellBank Australiawww.cellbankaustralia.com
Coriell Cell Repositoryhttp://ccr.coriell.org
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)www.dsmz.de
European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)www.phe-culturecollections.org.uk/
Health Science Research Resources Bank (HSRRB), Japanwww.jhsf.or.jp/English/index_e.html
Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB)http://cellbank.nihs.go.jp
NIH Stem Cell Unithttp://stemcells.nih.gov/research/nihresearch/scunit/
RIKEN Gene Bankhttp://en.brc.riken.jp
UK Stem Cell Bank (UKSCB)www.ukstemcellbank.org.uk/
WiCellwww.wicell.org

二、细胞储存
一旦细胞系已经开发或获得并验证(即显示为真实且未受污染),确保可靠且可重现的细胞供应的第一步是冷冻保存约20个1 ml安瓿瓶,每个安瓿瓶中装有1~5*10^6个细胞。这将为绝大多数实验室提供多年的现成货源。通常是在防腐剂(通常是含有10%DMSO的生长培养基)中缓慢(通常1 ℃ min-1)冷冻样品来保存细胞系。某些细胞类型,例如hESC,可能需要超速冷冻或玻璃化,其中水被原位冷冻形成玻璃,并且不允许像慢速冷冻一样从细胞中渗透出来,通常用于冷冻干细胞。每次冷冻一批细胞时,建议立即复苏一个小瓶以检查其生存能力。从库中取出的小瓶应快速融化(通过浸入37°C的水浴中),并用预热的培养基逐渐稀释细胞悬液。必须将可能具有传染性的材料存储在气相液氮中,以减少污染性生物转移的风险。安全起见,重要的物料(例如MCB)可以分开储存到一个以上的储存容器中,最好在放置到不同的位置,做好使用的登记记录。细胞的位置应在电子表格或数据库中详细说明,并与细胞系的起源和特征以及已应用的质量控制措施的详细信息进行关联。冷冻储藏容器应装有警报器,并定期检查储存温度。建议每周至少一次记录储存容器中液氮的水平。对定期维护,监视和库存控制的证据进行定期审核还将有助于确保存储设施的安全性。

三、细胞错误识别
错误识别是由于交叉污染,控制不当或文书错误造成的,并暗示了良好的细胞培养方法(GCCP)的失败;例如,将细胞意外转移到培养基的储液瓶中,该储液瓶在MSC中同时具有两个细胞系,贴错了烧瓶或安瓿的标签,或解冻了错误的安瓿。交叉污染的其他来源是饲养细胞(例如,在ES细胞培养中经常使用的)由于辐照或siliemeisuC处理不充分仍具有有丝分裂活性,或者是制备的条件培养基且未进行充分过滤以除去细胞。每当在实验室中维持快速生长的连续细胞系时,就有可能交叉污染(即替换)其他生长较慢的细胞系的风险。我们可以从ICLAC(ICLAC,2013a)获得已知的错误识别的细胞系列表。但是,即使某个细胞系不在该列表中,实验室也应始终进行测试以确保其自身的该细胞系库存是真实的。因此,必须采取简单的预防措施以最大程度地减少细胞错误识别的可能性,这些措施包括:
(1)所有培养容器以及存储容器都必须小心且正确地贴上标签(包括细胞系的全名,传代号和转移日期);
(2)生物安全柜一次只能使用一个细胞系。 取出细胞后,应在安全柜中用适当的液体消毒剂擦拭并运行至少5分钟,然后再引入另一个细胞系;
(3)瓶或等分试样只能用于一个细胞系;
(4)气溶胶的形成必须控制在最小程度;
(5)应定期返还冷冻存量(除非必要,否则切勿细胞系连续培养43个月或10代)

四、细胞的真实性验证
不管原代培养还是引进,细胞使用时仍需进行适当鉴定。培养细胞的鉴定主要有6个方面的要求:
1 证实其来源的物种
通过细胞遗传学进行染色体检测,进行细胞同工酶种类的检测,一方面确认其起源物质,另一方面排除与其他种属来源细胞的交叉污染。
2 与来源组织的关系
通过免疫细胞化学、RT-PCR、Western Blot 等方法,检测细胞中特定分子的表达,确定细胞所在组织中的细胞类型;确定细胞所处的分化发育过程中的位置(例如,干细胞阶段、前体细胞阶段或分化阶段)。
3 确定细胞系是否转化
通过体内移植,成瘤性观察实验,明确该细胞系是有限细胞系还是连续细胞系;细胞系是否表达恶性特征。
4 确定无细胞系交叉污染
通过细胞DNA 分型(指纹、SSP、STR、SNP)分析,与细胞培养初代和同一来源组织、血液细胞DNA 型进行比较,确认细胞系无交叉污染。也可通过同工酶检测及细胞遗传学检测。
5 是否有迹象表明细胞系有遗传不稳定的倾向性,易于转化和表型的多样性
通过染色体分析或FISH 等检测进行观察和证明。
6 特定细胞系需要独特特征的证明
一组起源相同的细胞中的特定细胞系,挑选出的细胞株或杂交细胞系,需要提供该细胞系或细胞株独特特征的证明,如分子标记特征。

具体到每株细胞系,并不是所有的指标都进行实验验证。STR分型分析是鉴定细胞系的标准方法。美国标准(ASN-0002 2011)提供了有关如何使用STR分析进行人类细胞系认证的信息。应遵循该标准的建议,包括使用至少八个核心STR基因座和应用匹配标准(匹配阈值80%),以允许某些细胞系中发生少量遗传漂移。

五、支原体污染
1950年代首次注意到细胞培养物被支原体污染,但令人遗憾的是仍然经常忽略它的存在。我们要清楚的知道如下几点,对于我们在平常实验中重视支原体污染问题非常重要。
(1)在世界范围内,支原体污染非常频繁。
(2)使用有支原体污染的细胞会导致错误,误导或错误的实验结果。
(3)由于缺乏明显的体征,支原体阳性细胞培养可能不被注意。
(4)注意支原体污染的潜在来源
(5)使用良好的无菌技术和实验室操作规程,避免支原体污染。
(6)对所有未经测试的细胞系采取有效的隔离程序。
(7)建立定期和连续的支原体检测程序。
(8)科学期刊开始接受支原体检测的证据,然后再接受论文发表。
支原体污染对宿主真核细胞的影响程度变化很大,但已显示出它可以改变许多宿主细胞的功能,包括生长,形态,代谢,基因组和抗原性。因此,在实验中使用被支原体污染的培养物将引来对所产生的任何研究数据的有效性和重要性的明显质疑,并可能导致发表错误的实验结果。现在越来越多的期刊在接受论文发表前要求提供证据证明研究中已使用细胞培养物不存在支原体的污染

六、总结
1、启动新的细胞系时,请记录与组织起源有关的所有数据,并保留组织用于DNA分析。
2、确保新细胞系的名称是唯一的。
3、获得的细胞系应来自可靠的来源,并且必须经过身份验证以避免错误识别。
4、应当将经过身份验证的细胞保存起来,以备将来使用,并定期从冷冻库中更换培养物。
5、获取细胞系组织有道德和法律上的要求。使用人体组织样品通常需要患者同意,并且必须定义所有权。
6、将人体组织样本作为可能具有传染性的材料处理。
7、在开始实验之前,为所有类型的实验室废物建立正确的处置途径,确保工作人员接受适当的培训。
8、从信誉良好的来源购买培养基和试剂(尤其是血清)。
9、记录实验所用的所有试剂和介质的批号。
10、建立“标准操作程序”(SOP)。良好的细胞操作规范可以很大程度上避免其他污染。
11、确保实验室设备的所有物品(柜,培养箱,高压灭菌器,水过滤装置等)均得到适当维修,并在规定的范围内工作。
12、错误识别仍然是一个主要问题,因此所有细胞系均应从可靠来源获得并证明是真实的。13、支原体的污染仍然很普遍,需要良好的组织培养实践和频繁的测试以确保细胞系清除污染。

迄今为止,只有少数领先的研究实验室和科学期刊采取措施来改变继续使用错误标识的细胞系的可怕局面,承担着发布高质量受控数据的责任。毋庸置疑,期刊和科学协会的企业将极大地促进此类质量控制措施并加速其广泛接受。让我们大家共同努力,从你我做起,保证所发表的文章数据真实可信,可被重复。



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