课堂 | 把好电镜制样最后一道关口——染色

来源: 徕卡显微系统(上海)贸易有限公司   2020-1-16   访问量:2012评论(0)


“七分制样,三分电镜”,这是电镜人常挂在嘴边的一句话。电镜最后的结果好不好,很大程度上取决于样品制备。样品制备的最后一步,就是染色。


染色,是为了提高样品在电镜下的反差。图像的反差通常来源于样品对电子束的散射能力,而它的散射能力则取决于原子组成。

  • 原子序数越高,电子密度越高,散射电子能力越强,电镜下显黑色;

  • 原子序数越低,电子密度越低,散射电子能力越弱,电镜下显白色。


生物样品主要由 C、H、O、N、P、S 等低原子序数的元素组成,不足以形成足够的反差。若利用重金属离子对不同细胞结构的结合能力不同,使各细胞结构对电子产生不同散射程度,则可以增强样品的反差。


常用的染色剂有醋酸铀和柠檬酸铅(pH 值在 11 左右)。

醋酸双氧铀:以提高核酸、蛋白质和结缔组织纤维的反差为主。

柠檬酸铅:对各种组织结构都有广泛的亲和作用,尤其是细胞膜系统及脂类物质,对不能被锇酸染色的糖原更具有染色作用。


结合铀和铅不同的染色特性,目前超薄切片染色大多都是将两种试剂结合互补,双重染色。即先用醋酸铀染色后,再用柠檬酸铅,以获得满意的染色效


染色方法主要有两种:

  1. 组织块染色:在脱水至 70%乙醇或丙酮时,将组织块放在用 70%乙醇或丙酮配制的饱和醋酸铀溶液中,染色时间 2 小时以上,或在冰箱中过夜。切片后无需铀染,直接柠檬酸铅染色。

  2. 切片染色:对载网上的超薄切片进行染色,通常为双染色,即先进行醋酸铀溶液染色,一般 10-30min,双蒸水清洗后再进行柠檬酸铅染色,一般 5-15min,铅染后双蒸水清洗。染色方法如下:


剪一片封口膜,铺在桌面上,使用时揭开保护层,滴数滴染液于封口膜上,用镊子夹住载网的边缘,把贴有切片的一面朝下,使载网浮在液滴上,盖上培养皿,染色 10-30min。染色时尽可能避光。载网从染液中取出后,必须尽快用双蒸水清洗干净。在染色过程中,铅染液容易与空气中的二氧化碳结合形成碳酸铅颗粒,而污染切片。因此,在保存和使用染液时,要尽量减少与空气的接触。为防止铅沉淀污染,可在培养皿内放置少许氢氧化钠,以吸收空气中的二氧化碳。


另一种方法是,使用商业化的染色硅胶板,多为圆形,用镊子夹住载网边缘,将其插在硅胶板缝隙中,在载网两边滴加染液,盖上培养皿,清洗时,可直接用洗瓶冲洗多次即可。


也有商品化的仪器可供选择,如 Leica EM AC20 全自动电镜载网染色仪(图 1)

图 1.Leica EM AC20



与手工方法相比

  • 安全 – 用户与试剂无接触

  • 获得重复性结果

  • 节省时间

  • 每次操作可染色 20 片铜网

  • 可过夜操作

  • 自动废液分离收集

用户可自行配置染液或选择商品化的真空染液包,确保操作者与有毒试剂没有任何接触。


图 2.控制面板

操作简便(图 2)

  • 简洁的区块化设计。

  • 操作直观。用户只需设定染色时间和温度。

  • 每个人都可以快速学习、操作 AC20,节省大量的培训时间。

  • 可记录 10 组程序。

  • 足够应用于各种不同的染色需求。

  • 每一类样品都有相应的存储的程序;选择程序,开始染色,节省时间,获得重复性结果。

图 3.载网装载和卡口封闭

每次操作可染色 20 片载网,提高效率,节省时间和成本(图 3)

  • 优化设计的样品仓尺寸和几何形状,更低的试剂消耗,更好的衬度。

  • 网格腔室为卡口式设计。

  • 是否关牢,一目了然。

  • 安全。

图 4.特殊的 3 向阀设计

用于 3 向阀 / 软件控制的探测器(图 4)

  • 3 向阀带有探测器,3 向阀是指向染色还是清洗管路被实时监控。

  • 避免用户错误操作。

  • 可获得更好的染色结果,且操作简单。

图 5.自动废液分离装置

自动废液分离收集,保护环境(图 5)

以下是 Leica EM AC20 用户测试结果。













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