【中科项目文章】IF=11.1 LIPUS治疗滑膜炎的机制性研究

来源: 上海中科新生命生物科技有限公司   2020-1-13   访问量:2214评论(0)

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SQSTM1-dependent autophagic degradation of PKM2 inhibits the production of mature IL1B/IL-1β and contributes to LIPUS-mediated anti-inflammatory effect

Autophagy IF=11.059

研究背景


骨关节炎(osteoarthritis, OA)是最常见的骨关节疾病,可造成关节疼痛和功能障碍。滑膜炎在骨关节炎(OA)的发病机制中起着重要作用,对关节功能的影响非常大。低强度脉冲超声(LIPUS)作为一种无创性的物理治疗手段,临床上LIPUS主要用于新鲜骨折的保守治疗和骨折不愈治疗等。前期临床研究表明LIPUS可以缓解OA患者的疼痛,提高生活质量,但相关深入的机制有待进一步解析。

研究材料


内侧半月板失稳模型鼠(MMD),脂多糖(LPS)诱导气囊模型鼠,THP-1细胞,RAW 264.7细胞,C57BL/6小鼠分离的骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)

技术方法

IP-MS

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. MMD模型鼠表型数据

构建内侧半月板失稳模型鼠(MMD),通过比较阴性对照组,模型组(MMD)和LIPUS治疗组(MMD-LIPUS)发现,经过一周的LIPUS治疗后,受伤爪子的占空比得到改善,并且几乎恢复正常(图1F,G)。表明LIPUS可加速DMM模型早期异常步态模式的恢复。进一步对损伤膝关节进行组织学分析发现手术小鼠关节损伤后滑膜炎症较对照小鼠严重,而LIPUS可以有效减轻DMM手术小鼠的滑膜炎症状。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. 脂多糖(LPS)诱导气囊模型表型数据

作者在另一种滑膜炎模型:脂多糖(LPS)诱导气囊模型鼠中再次确证了LIPUS的治疗效果:LIPUS治疗减轻了滑膜样组织的厚度,大大降低渗出液中IL1B的水平,但巨噬细胞数量不受LIPUS的影响。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

3. 细胞层面挖掘关键蛋白

通过对IL1B含量以及IL1B成熟过程中的关键组分PYCARD的检测发现LIPUS降低了DMM模型以及LPS诱导气囊模型中滑膜巨噬细胞的PYCARD水平。而且LIPUS治疗显著减低了DMM手术小鼠滑膜中表达IL1B的细胞数量。通过对LPS-ATP循环处理的巨噬细胞以及C57BL/6小鼠中分离出的骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)中的IL1B含量的检测,证实LIPUS可以抑制LPS-ATP处理的巨噬细胞产生成熟的IL1B。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

通过对LPS-ATP处理的骨髓源性巨噬细胞(BMDMs),THP-1细胞,Raw 264.7细胞中自噬相关标记MAP1LC3B-I/II表达量检测,发现LIPUS处理后巨噬细胞的自噬通量增加,进而抑制成熟IL1B的产生。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

前人研究发现,SQSTM1蛋白水平与IL1B成熟密切相关,而且可以通过自噬降解。作者通过放线菌酮(CHX),溶酶体抑制剂BafA1以及ATG7 siRNAs处理,发现LPSATP处理显著降低了LPS-ATP处理的THP-1细胞、BMDMs和Raw 264.7细胞中SQSTM1的蛋白水平。通过后期的SQSTM1敲除和过表达实验证实LIPUS通过自噬介导的SQSTM1降解可以抑制LPS-ATP诱导的巨噬细胞中成熟IL1B的产生。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

4. 分子调控机理探索

利用IP-MS技术寻找LIPUS抗炎作用的关键蛋白,发现PKM2与SQSTM1存在相互作用,尤其是LIPUS处理的条件下,SQSTM1和PKM共存(SDS-PAGE),且可以共定位(激光共聚焦显微镜)。通过对放线菌酮(CHX),ATG7 siRNAs处理、SQSTM1敲除的巨噬细胞以及两种小鼠模型组织中PKM蛋白情况的分析证实LIPUS促进了PKM2降解。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5. 分子调控模型

LIPUS显著增强了自噬通量,促进SQSTM1-PKM复合物的形成,从而以SQSTM1依赖的方式促进PKM的自噬降解,最终抑制了滑膜巨噬细胞成熟IL1B的产生;最终LIPUS治疗可以改善动物模型的滑膜炎症和异常步态。

 

 



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