小磁珠,大用途,分选纯化,一个不落

来源: 上海翊圣生物科技有限公司   2019-12-17   访问量:628评论(0)

【干货】小磁珠,大用途,分选纯化,一个不落

引文:

基因测序越来越得到临床的认可,尤其是精准医疗概念提出以后,更是备受青睐,为精准治疗解答很多未知的问题。高通量测序技术的跨越式发展,使测序能力大幅上升,整个NGS工作流程中,测序文库的纯化与筛选亦尤为重要。今天,我们就聊一聊核酸纯化分选小能手——磁珠。

一、背景介绍

磁珠的发明构想最初来自于挪威科技大学的化学家John Ugelstad 1976年他以聚苯乙烯为主要材料,制造出均匀磁化的球体粒子。1979Vogelstein等报道在高浓度碘化钠存在下玻璃粉末作为吸附剂用于从琼脂糖凝胶中提取DNA片段,而后基于硅胶和其他具有亲水性表面的载体的固相核酸纯化技术广泛发展起来。

二、原理解读

在整个体系中,影响DNA回收的因素包括聚乙二醇(PEG)、DNA大小和浓度、孵育时间等,其中PEG是影响DNA回收的决定性因素。DNA在较高浓度的PEGNaCl中脱去分子水化层,分子构象由线状被压缩成卷曲球状,并暴露出大量带负电荷的磷酸基团,带负电荷的磷酸基团与羧基在Na+的作用下形成电桥,使DNA被特异吸附到磁珠表面。当PEGNaCl被去除之后,加入水性分子,会快速充分水化DNA,解除三者间的离子作用,使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。 此外,不同长度的DNAPEG分子量、浓度以及盐浓度的不同,可以被选择性的沉淀出来。

磁珠纯化原理示意图

三、应用

磁珠凭借其高通量,适用于自动化的特点在高通量测序中备受推崇,并广泛用于NGS建库中的产物纯化/分选。

1. DNA纯化

DNA纯化的目的在于去除不要的DNA片段由于磁珠优先吸附大片段,因而可通过一定比例的磁珠吸附特定大小以上的片段,丢弃上清中的非目标片段,之后将磁珠吸附的目的DNA洗脱回收。常用于小片段如接头二聚体/引物二聚体的去除。此外还有一些客户会用于样本的富集。

DNA纯化操作示意图

DNA样本经磁珠纯化后会有部分样本的损失,磁珠回收效率可评估磁珠的回收能力。通常可通过计算得出:回收效率=(纯化后的DNA质量/Input DNA质量)×100%,如下表:

磁珠回收效率计算

测试人

样本编号

投入量(ng

纯化后总量(ng

回收率(%

平均回收效率(%

测试人1

1.8×)

A

169.5

153.25

90.41

90.41

B

159.75

94.25

94.5

C

162

95.58

D

158.75

93.66

测试人2

1.8×)

A

169.5

154.5

91.15

91.15

B

155

91.45

91.94

C

154.25

91

D

158.25

93.36

【注】:磁珠测试数据来源于上海某生物公司, 表格中AB*磁珠BCD分别是翊圣个不同批次磁珠。

2. DNA双轮分选(片筛)

由于二代测序段短读长的局限性,所以最终的NGS文库需满足一定的长度要求。片筛的目的在于从片段化DNA中选择特定区域的DNA片段以满足上机需求比如将样本中的片段分布比作下图中的正态分布,由于磁珠优先吸附大片段,所以第一轮磁珠吸附目的片段以上的大片段,此时弃磁珠留上清(目的片段在上清中)。第二轮磁珠吸附目的片段,此时弃上清,再将磁珠上的目的片段洗脱回收。

DNA双轮分选操作示意图

分选精度则是评估不同的磁珠投入比例分选得到的片段大小。一般以Agilent 2100仪器检测。

在特定磁珠比例(0.45×/0.15×)条件下,不同样本分选后片段分布范围集中在同一位置。较好的分选效果应该是顶部窄而圆润的独峰。此外不同厂家由于buffer的不同在特定磁珠比例条件下分布也会有一定的差异,使用前需根据各厂家相应的说明书确认目标片段的分选比例。

不同样本磁珠分选精度示意图

四、明星产品推荐

产品名称Hieff NGS® DNA Selection Beads(点这里)

产品特点:

1)品质保证:采用进口原材料,品质高度稳定。

2)无缝替换:产品原理、产品操作和实验结果与AMPure XP保持高度一致。

3)兼容性高:兼容目前市面上所有的DNA/RNA建库试剂盒。

4)批次稳定:严格的批次性能与稳定性质控,单次产能20L

性能展示1:分选效果与XP高度一致:如下图所示,相同的分选比例,翊圣磁珠与XP磁珠,分选效果相当。

磁珠分选精度与XP对比示意图

性能展示2:回收效果与XP高度一致:如下表所示,分别用0.8x0.6x的回收比例对DNA marker和打断的gDNA进行回收,翊圣3个批次的磁珠和XP磁珠回收效果相当。

【注】:磁珠测试数据来源于杭州某生物公司, 表格中分别B*磁珠翊圣个不同批次磁珠。

磁珠介绍到这里就结束了,希望以上总结可以帮助到正在努力实验的你。



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