基因功能研究常用方法简介

来源: 上海吉凯基因化学技术有限公司   2019-12-13   访问量:1142评论(0)

基因功能研究一般先用生物信息学分析对基因的结构和功能做预测,然后就要对我们的推测进行验证,如何验证一个基因的功能,目前最常用的基因功能研究策略为功能获得与功能失活。

功能获得策略 是指将基因直接导入某一细胞或个体中,通过该基因在机内的表达,观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化,从而鉴定基因的功能常用的功能获得的具体方法有基因过表达技术以CRISPR-SAM技术等。

基因的过表达技术:基因过表达技术是指将目的基因构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游,通过载体转入某一特定细胞中,实现基因的表达量增加的目的,可以使用的载体类型有慢病毒载体,腺病毒载体,腺相关病毒载体等多种类型。当基因表达产物超过正常水平时,观察该细胞的生物学行为变化,从而了解该基因的功能。基因过表达技术可用于在体外研究目的基因在DNARNA和蛋白质水平上的变化以及对细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程的影响。

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CRISPR-SAM技术: CRISPR-SAM系统由三部分组成:第一个部分是dCas9VP64融合蛋白;第二个部分是含2MS2 RNA adaptersgRNA;第三个是MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白。CRISPR-SAM系统借助dCas9-sgRNA的识别能力,通过MS2MS2 adapter的结合作用,将P65/HSF1/VP64等转录激活因子拉拢到目的基因的启动子区域,成为一种强效的选择性基因活化剂,从而达到增强基因表达的作用。

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功能获得两种方法的比较:基因的过表达技术与CRISPR-SAM技术都能达到基因表达的上调,但是由于基因的过表达技术使用的载体容量的限制,导致基因的过表达技术只能用于研究一定长度内的基因。而CRISPR-SAM技术是通过增强目的基因启动子的转录而实现基因的过表达,可以不受基因大小的限制。

功能失活策略 是指使待研究基因的功能部分或全部失活,通过观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状在基因功能失活后的变化,来鉴定基因的功能,常用的方法主要有RNAi干扰和CRISPR/CAS9基因敲除等。

RNAi干扰:该技术是指由小干扰RNA(small interfering RNAsiRNA)所介导的转录后基因沉默现象。双链RNA(double strand RNAdsRNA)RNAi核酸酶Dicer结合后,被切割成21-23ntsiRNA,再被输送到RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complexRISC),并引导RISC与同源性mRNA结合。核酸酶在siRNA反义链与mRNA所形成的双链区的中央区域切断并降解mRNA,导致靶基因的转录后沉默。

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CRISPR/CAS9基因敲除技术:CRISPR/CAS9系统利用sgRNA来识别靶基因DNA,并引导Cas9核酸内切酶剪切DNA。当基因组发生双链DNA断裂后,细胞通过非同源性末端结合(NHEJ)将断裂接合,在此过程中,将会随机引入N个碱基的缺失或者增加。若N3的倍数,则目的基因发生移码,实现基因功能的丧失。

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功能失活两种方法的比较:RNAi技术可特异性的抑制靶基因的表达,不仅能灵活组合同时抑制多个靶基因,还可用于大规模的基因筛选,已被广泛用于基因功能研究和基因治疗领域。CRISPR/CAS9基因敲除技术不同的是:RNAi技术是从mRNA水平对目的基因进行敲减,而CRISPR/CAS9基因敲除技术是从基因组水平对基因进行敲除,可以做到完全消除目的基因在细胞内的表达,靶蛋白的功能也因此完全丧失。此外,CRISPR/CAS9基因敲除技术靶点选择范围可以扩大到整个基因组序列,包括启动子,内含子。

以上是对基因功能获得和功能缺失技术的简单介绍,同时也介绍了部分类别产品的用途及特性。运用基因功能获得和功能失活的方法,可以直观的通过观察该细胞的生物学行为改变或实验动物整体功能状态的改变,来推测该基因的功能。在某些情况下,两种方法的联合使用可以更好的研究基因的功能。



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