pcDNA3.1(+)/GFP基因工程的基本操作程序：

1、目的基因的获取

（1）目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因。

（2）获取方法：①从基因文库中获取；②人工合成（反转录法和化学合成法）；③PCR技术扩增目的基因。

2、基因表达载体的构建

（1）pcDNA3.1(+)/GFP目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

（2）组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因。

(1)将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRⅠ酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DN**段之间连接形成的产物有目的基因和载体连接物、载体和载体连接物、目的基因和目的基因连接物三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行分离、纯化(或筛选)。

(2)pcDNA3.1(+)/GFP用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞进行转化实验。之后将这些宿主细胞接种到含四环素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是载体和载体连接物；若接种到含青霉素的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物有目的基因和载体连接物、载体和载体连接物。

(3)目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是，其合成的产物是启动子mRNA。

(4)pcDNA3.1(+)/GFP在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶是_EcoRⅠ和BamHⅠ。XY4201 蛋白酶K 100mg

XY3301 2 x SYBR Green qPCR Mix (Sybr green荧光染料法定量PCR) 50次×50μl/200次×50μl

XY3901 2 x Real Time PCR Mix (Probe荧光探针法定量PCR) 40次×50μl/200次×50μl

XY3601 TUREscript SYBR Green qRT-PCR Kit (两步法荧光定量反转录PCR试剂盒) 25次×50μl/50次×50μl

XY4601 THERMOscript SYBR Green qRT-PCR Kit(两步法荧光定量耐热反转录PCR试剂盒) 25次×50μl/50次×50μl

XY4101 TUREscript One Step qRT-PCR Kit (一步法荧光定量反转录PCR试剂盒) 50次×50μl/100次×50μl

XY4201 THERMOscript One Step qRT-PCR Kit(一步法荧光定量耐热反转录PCR试剂盒) 50次×50μl/100次×50μl

XY3501 快速植物DNA提取扩增套装 50次/100次/200次

XY1701 TUREscript H Minus M-MuLV Reverse Transcriptase(反转录酶) 5000U/10000U/10000U×5

XY4301 THERMOscript H Minus M-MuLV RTase(耐热反转录酶) 5000U/10000U

XY1801 TUREscript 1st Strand cDNA (第一链反转录试剂盒) 25次/50次

XY4401 THERMOscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(第一链耐热反转录试剂盒) 25次/50次

XY3401 TUREscript One Step RT-PCR Kit(一步法反转录PCR试剂盒) 50次×50μl/100次×50μl

XY4501 THERMOscript One Step RT-PCR Kit(一步法耐热反转录PCR试剂盒) 50次×50μl/100次×50μl

XY4801 miRNA cDNA 第一链合成试剂盒 25次

XY4901 miRNA 荧光定量PCR检测试剂盒 50次×50μl

XY2001 长片段PCR扩增试剂盒 100次/500次