产品及特点

1.      本试剂盒是基于T7 RNA聚合酶的RNA体外转录试剂盒，它利用含有T7启动子的模版DNA，以四种NTP为底物，从T7启动子下游开始合成与模版DNA中一条链互补的RNA，简单快速获得大量的RNA分子。本产品具有下列特点：

2.      即开即用，用户只需提供含T7启动子的DNA模板即可以进行体外转录实验，不需要单独准备每一个成份。

3.      进行体外转录合成RNA时，本试剂盒不仅适用于含有T7 Promoter的线型Plasmid，也适用于带有T7 Promoter序列的PCR产物及Oligo DNA等。

4.      可以合成的RNA的最佳长度在20nt到2000 nt之间。

5.      产品配方经过精心优化，试剂盒中附带有Control Template，以20 ng的Control Template为模板，在20 μl的转录反应体系中，可以合成约10 μg的1 kb单链RNA。

6.      得到的RNA可以用于RNA 结构研究、核酶生物化学、体外翻译、RNA-蛋白质相互作用、反义技术、SELEX 技术和 RNA 干扰（RNAi）等实验。

规格及成分

运输及保存

低温运输，-20℃保存、有效期一年。

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一、制备DNA模板

PCR片段和质粒DNA都可以用作体外转录的模板，但是必须注意以下几点。一是必须使用线性化的DNA。如果是质粒DNA，则必须先用适当的限制性内切酶切成线状。二是需要转录的DNA序列的上游必须有T7启动子。如果模板时PCR产物，则可以在设计引物时将T7启动子序列（5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’）加上。如果是将DNA片段克隆到载体上，则需要选择有T7启动子的载体，并且克隆位点必须位于T7启动子下游。三是需要转录的DNA序列的下游端最好不要是3’突出。如果是3’突出（比如选择了Pst I来线性化质粒），则最好用T4 DNA聚合酶修平。四是必须保证DNA模板中没有RNase。由于提取质粒DNA的过程中一般要使用大量的RNase A，因此质粒DNA一般都有严重的RNase A污染，所以在用作模板前，最好采取胶回收得方法回收质粒DNA。并且加入少量总RNA一起保温，然后电泳检测RNA是否被降解，以此来判断纯化的DNA模板是否有残留RNase A。

二、体外转录

1.        在一个RNase-free 的塑料离心管中，在室温下（不是在4℃下）按次序加入下列成分：

2.        用封口膜包好管口，60℃水浴30min，使反应体系中的RNase抑制物充分发挥作用，以去除模板中的RNase。

3.        待反应体系冷却后加入1ul T7 RNA 聚合酶，37℃保温2小时。注意：延长保温时间不能明显提高产量。

注：此为20uL反应体系的用量，对其他反应体系，各成分的用量可以按比

    例增减。

4.        70℃加热10分钟灭活T7 RNA聚合酶。

5.        取1-3uL电泳检测转录效果。

6.        得到的RNA可以放-80℃保存。

三、去除DNA模板

1.        在体外转录体系中加入1 uL自备的 RNase-free DNase （3-5U/uL）。

2.        37℃保温15-30分钟。

3.        补水到100 uL，

4.        用等体积的Tris饱和酚-氯仿抽提一次

5.        加0.1 倍体积的3M NaAc和2倍体积的乙醇，混匀后最高转速离心15-30分钟，弃上清后加入1mL 70%的乙醇，振荡后最高转速离心2分钟，弃上清，晾干，所得沉淀即体外转录所得的RNA。

疑难解答

1、 没有RNA产物。最常见原因是模板有RNase污染，可用纯化的RNA跟模板DNA一起保温，再检测RNA是否降解。还可以增加RNase Inhibitor用量，本试剂盒缓冲液和酶混业液中有RNase inhibitor，如果模板RNase污染严重，可能需要用户补加RNase inhibitor。

2、 RNA产量低。最常见的原因是DNA模板。在转录序列的第一个和第二个碱基最好都是G，在前14个碱基内避免有U存在。

3、 RNA长度比预期的短。可能是模板序列中有T7 RNA聚合酶的终止序列。

4、 RNA长度比预计的长。T7 RNA聚合酶跟Taq DNA聚合酶一样，有不依赖于模板的加尾功能，最多有一半的RNA可以带一个或两个碱基的尾巴。如果RNA长度比预计的长很多，使用的模板又是质粒DNA，则可能是质粒DNA线性化不彻底。

5、 5’单磷酸还是三磷酸。如果使用GTP，则得到的RNA是三磷酸，体外转录时如果保温时间太长（如12小时），则有50%的三磷酸会变成单磷酸。如果在转录体系中加入GMP，则T7 RNA聚合酶将优先使用GMP，所得RNA产物中5’端是单磷酸的比例将大大增加。

关联产品

Oligo DNA/RNA 合成，rNTP，buffer 去RNase 试剂，T7 RNA polymerase