Western Blot试剂盒(大鼠,带PVDF膜)

中文名称：Western Blot试剂盒(大鼠,带PVDF膜)
英文名称：Western Blot Kit (Rat) with PVDF membrane
产品规格：100次
Western Blot是蛋白质分析的强大工具。该试剂盒可提供快速检测的大鼠源一抗，利用辣根过氧化物酶偶联的抗大鼠IgG抗体和底物3,3-二氨基联苯胺（DAB）产生棕色沉淀。所有试剂与PVDF膜一起足以分析总共50～100个样品。高度纯化的二抗偶联物和配套试剂具有良好的灵敏度，可以最大限度地减少物种的交叉反应。

试剂盒组成：

保存条件：4℃，有效期2年。（二抗及DAB请置于-20℃长期保存，避免反复冻融）

操作方法：

一、转膜：
1．准备转膜缓冲液：加入一个准备好包装的转膜混合物和200ml甲醇（如果需要），去离子水定容至1000ml。
2．切割滤纸和膜，用甲醇预处理的PVDF膜，将膜漂浮去离子水表面，直到其从下方开始完全润湿。
3．凝胶电泳完成后，从电泳室取出凝胶，切下含蛋白条带的凝胶。在凝胶右下角做一个小切口。
4．将凝胶浸入转移缓冲液中20分钟，将膜和滤纸也浸入转移缓冲液中。
5．用海绵和3张滤纸放置一个支架，用玻璃棒将所有的气泡赶出。
6．将凝胶放置在滤纸上，用玻璃棒将所有的气泡赶出。
7．将膜放置在凝胶的上面。在膜的右下角做一个小切口，以匹配凝胶右下角的切口，用玻璃棒将所有的气泡赶出。
8．将3张滤纸放置在膜上面，压出气泡。
9．在滤纸上方放置海绵，夹上转膜三明治。
10．将三明治置于转移室中，装满转膜缓冲液，确保膜面向正极方向。
11．进行转膜。
12．打开盒子，从膜上取出凝胶（凝胶可以用考马斯亮蓝染色来观察转印效率）。膜可以用丽春红染色10分钟，并用去离子水洗涤。

二、免疫印迹：
1．制备封闭液：向100ml 1×TBS中加入一袋备好的封闭剂。
2．将膜放在热封袋中，每平方厘米膜加入0.1～0.2ml封闭液，，尽可能地挤出空气，密封袋子，放在摇床上室温震荡1小时。
3．切下热封袋的一角，排出封闭液。
4．每平方厘米膜加入0.1～0.2ml封闭液，加入适当浓度的抗体，尽可能地挤出袋中空气，密封袋子，室温下在摇床上放置1小时（或4℃摇床上过夜）。
5．在摇床上用PBST（PBS中含0.05%Tween）洗涤膜5分钟，重复3次。
6．用TBS洗涤膜10分钟，每平方厘米的膜加入0.1～0.2ml封闭液，加入适当浓度的HRP共轭二抗（1:2500～50000），尽可能地挤出袋中空气，密封袋子，室温下在摇床上放置1小时。
7．在摇床上用TBST（0.05%吐温）洗涤膜5分钟，重复3次。在TBS中再洗一次。
8．制备DAB底物溶液：
  a）将一包DAB溶于10ml 1×显影溶液中，
  b）加入10μl过氧化氢。
9．印迹反应显色。
10．预期条带出现后停止反应，倒出溶液并反复用蒸馏水冲洗。将膜干燥并置于黑暗中。

注意事项：
1．使用适当的手套，干净的的手术刀和钝头镊子来处理膜。膜和滤纸应比凝胶大约1mm。
2．PVDF膜使用前需要用甲醇处理。
3．安装转印三明治时，每一步都需要用玻璃棒赶出所有气泡。
4．推荐稀释HRP标记二抗的浓度是1:2500～50000，如果印迹之后将用ECL或高背景观察，则二抗应进一步稀释（＞1:100000）。
5．在封闭好印迹步骤中，空气应尽可能从热封袋中挤出。
6．不要在印迹过程中立即使用膜，应彻底干燥并在室温下保存。 

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！