产品内容：

注意：I型（HZ006）为超声裂解法，II(HZ007)型为酶解法。均适用于可溶性和包涵体中His标签蛋白的纯化。

产品说明：

1.本试剂盒是基于 His-Ni 亲和层析的蛋白质纯化方法进行His标签蛋白纯化的试剂盒；

2.变性和非变性条件均可使用，也适用于纯化包涵体中的 His 标记蛋白。

3.最大载量为 20-30 mg His标记蛋白质/mL 介质。

4.本试剂盒可用于10次His蛋白纯化（50mL 体积的细菌)。

操作步骤：

一：裂解

1.将 Ni-Agarose 介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中。

注意：介质用量需要根据 His 蛋白产量决定，其最大载量为 20-30 mg His 标记蛋白质/mL 介质，请根据实验需要取适量的Ni-Agarose 介质加入层析柱。

2.用 5 倍柱体积（指填料的体积，下同）自备去离子水洗柱，共三次。

3.用 5 倍柱体积的洗涤液洗柱，共三次。

4.室温 5000 g 离心 10 min 收集 50 mL 表达菌液，弃上清，沉淀放冰上待用或放-80℃保存。最好用不加诱导物的菌液做对照样。

注意：以下成分均以50mL菌液计算用量，实际用量可根据菌体量增减。

5.(1)超声破碎细菌：加入 2.5 mL 冰浴的超声裂解缓冲液，再加入 60 uL PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上超声裂解菌体直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。

(2)酶法裂解细菌：加入 2.5 mL 冰浴的酶解液，再加入 60 uL PMSF（10 mg/mL）溶液，冰上放置 30 分钟。

6. 4℃下 13000-15000 g 离心 10 min，去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清，留样做SDS-PAGE 电泳对照。可溶的His蛋白在上清液中，包涵体的His蛋白在沉淀中。

二：纯化

A：纯化细胞裂解液中可溶部分的 His 标记蛋白

1.将上步得到的上清液上柱，用层析柱的盖子将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在 4℃结合 30 min-12h 后取掉盖子让重力使裂解液自然流出。

2.用 10 倍柱体积洗涤液洗柱，收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的 His 标记蛋白，可做 SDS-PAGE 电泳的对照）。

3.按下表配置含不同浓度咪唑的洗脱液，以确定His标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE 电泳检测 His 标记蛋白所在的区域。

注意：建议咪唑浓度梯度为：40、70、100、200、300、400、500 mM。

4.如已知咪唑洗脱浓度，可直接配置该浓度的洗脱液进行洗涤。

5.洗脱后，依次使用10 倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用 3倍柱体积的20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），最后堵住层析柱下端的漏口，4℃保存待下次使用。

B：纯化包涵体中 His 标记蛋白

1.将上步(一-6)得到的得到的包涵体沉淀重悬于 2 mL 含变性结合液中。冰浴 1 h 以使包涵体溶解，期间可轻柔摇晃几次。

2.室温 10，000 g 离心 20 min ，沉淀为未溶解的包涵体。将上清（含溶解后的 His 标记蛋白）以自备的针头过滤器（0.45 um）过滤。

3.将滤过液上柱，用层析柱的盖子将层析柱下的漏液口堵上，让细菌裂解液和介质在 4℃结合 30 min-12h 后取掉盖子让重力使裂解液自然流出。

4.用 10 倍柱体积包涵体变性洗涤液洗柱( 用去离子水将2×洗涤液稀释至1×后使用)，收集并保存穿透液（含杂质或没被吸附的 His 标记蛋白，可做 SDS-PAGE 电泳的对照）。

5.按下表配置含不同浓度咪唑的变性洗脱液，以确定His标签蛋白的最适洗涤液的咪唑浓度。按从低到高的顺序洗涤并收集样品，SDS-PAGE 电泳检测 His 标记蛋白所在的区域。