细胞表面抗原染色——间接标记
本篇文章由专业生化试剂供应商上海岚兴生物为您提供。
A. 所需溶液和试剂
1. 磷酸盐缓冲液 (C01-01002)：0.1M PH7.4 1X PBS
2. 固定液：4%多聚甲醛溶液（无甲醇）(C01-06001)；1%多聚甲醛溶液（无 甲醇）（C03-02001） 3. 穿膜剂(C01-03001)：0.3% tritonX-100
4. 抗体封闭液（C03-03001）：10%山羊血清溶液
5. 孵育缓冲液(C03-03002)：2% BSA 的 0.1M PBS 6. 抗体稀释液(C01-04001)：1% BSA, 0.03% Proclin300 的 0.1M PBS
B. 样本处理——固定
1. 离心收集细胞，弃上清。
2. 将细胞重悬在 1 ml PBS(C01-01002)中。加入等体积甲醛溶液(C01-06001) 至终浓度为 2%，37°C 固定 10 分钟。（或者用 70%的冰乙醇 5-10ML ,4℃ 固定 16 小时）
3. 放在冰上降温 1 分钟后加入 1 X PBS ，800rpm 离心 5min 去上清，重复一 次。
C. 抗体标记
1. 将 0.5-1 x 106 个细胞分到各检测管中。
2. 各管加入 2 ml PBS(C01-01002)，200g 离心 5 分钟, 回收细胞。重复一次。
3. 向每支检测管中加入 100μl 孵育缓冲液 (C03-03002)重悬细胞。
4. 向每支样品管中加入经抗体稀释液(C01-04001)按合适比例稀释后的无荧 光一抗，室温孵育 30 分钟。
5. 加入 2 ml 孵育缓冲液，200g 离心 5 分钟，离心回收细胞；重复一次。
6. 向每只检测管中加入 100μl 孵育缓冲液 (C03-03002)重悬细胞后加入 100μl 10%山羊血清的孵育缓冲液中（C03-03001），室温，封闭 15 分钟。
7. 加入一定比例稀释的荧光素二抗，室温孵育 40 分钟。
8. 重复步骤 5。
9. 将细胞重悬在 1%多聚甲醛溶液（C03-02001）中然后用流式细胞仪检测。
注意：
1）甲醛溶液加入量为 1X106 cells / m L。
2）冰乙醇与冰甲醇的加入方法： 向细胞中逐滴加入冰乙醇；向细胞中缓慢加入冰甲醇。
3）同型对照的设置。
4） 标记前细胞计数。