同位素质谱 HPLC 糖 蜂蜜 化合物特定同位素分析 LC IsoLink接口
前言
糖类是生命中最大和最常见的分子家族。糖类充当着能量的来源，DNA和RNA的主要组成部分，生物活性化合物的载体和植物组织结构的建筑材料。糖类能够携带其来源和处理加工过程的信息。如果用同位素标记，它可以告诉我们关于其循环途径和新陈代谢情况。
同位素质谱的应用是建立在对自然界中发生的物理和生化同位素分馏所产生的化合物中同位素间的最小差异的分析基础之上的。用同位素质谱仪所作的同位素示踪实验，只须使用极低量的示踪物质（<< 0.1 at%）就可给出糖代谢的途径和代谢率。超高精度同位素质谱甚至能对新陈代谢过程中的天然示踪物质：如C-3化合物中的C-4化合物进行分析。C-3和C-4是CO2在植物中固定的两种途径的首字母缩写，这两种固定途径导致了碳的13C/12C同位素比之差为15‰（δ符号，～0.015at%），高精度同位素质谱的测量精度优于± 0.2 ‰，与其相比，这已经是一个大范围了。
糖混合物的δ值及重复性的irm-LC/MS测量结果
同位素比监测-液质联用仪（irm-LC/MS）包括LC IsoLink接口是分析糖类的可选技术。既不需要连接气相色谱，也不需要连接元素分析器（EA）就可完成。
小样品量复杂混合物用于做化合物特定同位素分析，无需大量的准备或衍生化工作。对于irm-LC/MS来说不存在由于糖类乙酰化产生的同位素转移。由于不需要衍生化并减少了准备的步骤，用irm-LC/MS分析糖类将得到更准确、更精密和更快速的结果。
一种新的方法是对水溶液中的总体亚微克级样品的同位素分析。样品准备的容易度、分析速度（<100秒/样品）和高灵敏度（EA法的100倍）较传统EA法优越得多。
糖混合物的irm-LC/MS色谱图
irm-LC/MS色谱条件
irm-LC/MS技术
LC IsoLink是第一种连接高效液相色谱（HPLC）与同位素比质谱的高灵敏度接口，用于重复并精确地联机测定13C/12C同位素比。在保证色谱分辨率的条件下，可分析所有从HPLC色谱柱上洗脱下来的有机化合物。
在LC IsoLink接口中，样品在HPLC的洗脱水溶液中被氧化，然后生成的CO2从液相中分离出来。这个过程是定量的和自由分离的过程。
氧化物由两种溶液组成：氧化剂和催化剂。它们分别由泵抽取并加入到流动相中。在该混合物中所有从HPLC色谱柱上洗脱下来的单有机化合物在通过一个加热的反应炉时被氧化成一定量的CO2，在一个流动方向向下的分离单元中，CO2从液相中被去除，然后被嵌入He气流中，He中的单个CO2峰随即通过一个联机气体干燥单元（Nafion™）干燥，然后通过一个打开的狭缝接口进入同位素比质谱。
带LC IsoLink接口的irm-LC/MS 系统原理图
掺假蜂蜜的检测
蜂蜜是一种高品质的天然甜味剂，是由蜜蜂从花蜜或蜜露中生产出来的。植物花蜜主要由葡萄糖和含蔗糖的果糖组成，还含有少量的葡萄糖和果糖的双糖化合物。这种混合物或者化合物可以用其他来源添加而成以假冒蜂蜜，如高果糖玉米糖浆（四碳糖）。
直到现在，对于用C4糖制作的掺假蜂蜜的检测是测量蜂蜜的δ13C值和与EA法相比得到的它的蛋白质百分比。但是这种方法对掺假品的可靠的检测限是四碳糖添加物的碳含量为7%，另一种技术是使用HPLC进行糖的图像识别。然而多同位素分析很难检测低量的C-4糖掺假品，尤其添加了C-3糖的掺假品。
有了HPLC和同位素比质谱的结合便可填补这个空白，蜂蜜中每一种单糖的δ13C值都能分析。果糖和葡萄糖的δ13C的比值，其他不常见糖类的检测，还有各种糖样本的测定都可以在一个单次HPLC操作中确定。
在不同的两天时间，分两批次分析了3号蜂蜜的4份相同样品，结果证明了irm-LC/MS方法的精密度和可靠度。葡萄糖的平均δ13C值为-24.86 ‰ ± 0.05 ‰，果糖的平均值为-24.86 ‰ ± 0.15 ‰，蔗糖随其他少量化合物洗脱，不用于精密测定。
表1：8个蜂蜜样品的irm-LC/MS和EA分析结果
表1所示是用irm-LC/MS和EA分析的8个蜂蜜样品，以给出天然蜂蜜和掺假蜂蜜的不同情况。EA法可检测出2个掺假蜂蜜产品，irm-LC/MS法检测出4个掺假的产品。
峰蜜1的Flu/Glu比值正常，但是由于其很小的负δ值，超过了-23.5 ‰，仍怀疑为掺假产品。蜂蜜主要成分和蛋白质的比较表明有16.7%的掺假率。
蜂蜜1
蜂蜜2显然为100%的四碳糖。由于蛋白质不能沉淀，所以不能用测蛋白质法。用irm-LC/MS法可以检测在蔗糖之前的四分之一的糖，峰面积的Flu/Glu比为0.65，蔗糖和葡萄糖一样多，果糖的δ13C值比葡萄糖还小2.7‰，这最终证明了此蜂蜜为人工制作。
蜂蜜2
蜂蜜5是掺假产品，但是不能用同位素比的方法检测出来。尽管如此，Flu/Glu比为4.53还是说明了它是人工蜂蜜。
蜂蜜5
蜂蜜8没有用EA法检测是因为0.3‰的差（掺加1.5%四碳糖）在该方法的不确定度之内。葡萄糖和果糖的δ13C差1.3‰清楚地表明该蜂蜜是掺假的。通过比较，Flu/Glu比为2.17还说明添加了含三碳糖的果糖。
用直接循环注射的μ-EA法
LC IsoLink接口使用直接安装在HPLC色谱柱之后的直接循环注射器，提供了一种快速分析多种样品的方法。
多样品的处理方法与HPLC分离化合物的方法一样。
这种μ-EA法可用于在如下色谱图中所示的全部可溶性物质的超快多种样品分析。该方法的优点是直接与某一已知δ13C值的标准样品比较，一次分析循环时间<100秒。
这种相同的技术也可用在每一次HPLC的运行过程中。在分析多样品的开始或者结束时，可以注射进某些标准物质而几乎不损失分析时间。
表2是样品对已知δ13C值为-29.9‰的苯甲酸分析的结果。EA法（表1）和μ-EA法的分析结果中平均差为0.5‰，这可能是由于所采用的参考间的差异，也可能是因为μ-EA法只分析可溶于水的化合物的原因。
表2 8种蜂蜜样品的μ-EA法测量结果
μ-EA法：多种蜂蜜样品直接循环注射分析
参考文献：
(1) Demmelmair H. et al., 1995, J. Pediatr Gastroenterol. Nutr., 21, 31-36
(2) White J.W., 1992, Journal of the Association of Official Analytical Chemists, 75, 543-548
(3) Földhazzi, G., 1994, Acta Alimentaria, 23, 299-311
感谢APPLICA GmbH，感谢Bremen提供蜂蜜样品和EA结果。
δ13C表示待测样品的13C/12C同位素比值对标准样品的13C/12C同位素比值的千分差，以保证数据的国际互换性。
δ13C= ((13C/12C)样品 / (13C/12C)标准 – 1) × 1000
δ13C的粗略估计值与原子百分比除以1000（atom%/1000）相关