目前全球生物医药产业发展处于快速上升期，后疫情时代的医药健康行业，迎来新一轮的变革与机遇。其中，抗体药物、细胞与基因治疗药物被认为是未来医药领域发展的主力军。无论是抗体药物的生产还是基于病毒载体的基因治疗药物的制备，都涉及单克隆细胞株的筛选。在工艺开发过程中，研发人员需要分离单细胞克隆，筛选出高产且稳定的细胞株来建立种子细胞库和工作细胞库，用于后续的病毒载体或抗体等药物的生产。

2020年，美国食品药品监督管理局（FDA）更新了关于基因治疗临床试验申请(INDs)的化学、制造和控制指导原则（Chemistry, Manufacturing, and Control Information for Human Gene Therapy Investigational New Drug Applications），内容包含稳转细胞株开发及细胞克隆性确证等。文件指出，细胞库（Cell bank）的稳定性及纯度是一个需要考虑的重要方面（https://www.fda.gov）。非单克隆来源的细胞群中，其细胞异质性相对较高，外源蛋白产量低的细胞系往往与蛋白高产的细胞群体竞争，导致高产细胞个体占比越来越少，最终随着传代次数的增加，导致细胞库或工作库的质量下降，因此，通过单克隆细胞筛选是提高病毒载体质量的重要步骤。单克隆源性的确证是一种控制细胞种群降低其异质性的方法，通过防止异种细胞群体的产生，来保障未来生产出的病毒产品的质量不受影响。CEVEC公司（CEVEC Pharmaceuticals）针对 ELEVECTA® AAV包装细胞系的研究数据显示，通过单克隆筛选出的细胞株其AAV产量要比非单克隆细胞来源的高10倍左右（https://cevec.com）。除了细胞基因治疗产品，针对抗体药物，FDA的政策法规也要求工艺生产细胞系须是从单个祖细胞克隆来源的，生物制药企业需提供有力的数据证据以证明药物研发过程中的单克隆源性，上述相关的政策法规对药物开发制备工艺中细胞单克隆筛选操作及细胞单克隆源性确证提出了更高的要求。

目前常见的单克隆细胞筛选方法，包括有限稀释法、半固体培养基筛选法、流式细胞术分选及单细胞分离法等。有限稀释法、半固体培养基筛选法的优点是对细胞的物理损伤小，弊端是耗时长、效率低，此外，半固体培养基筛选法采用的荧光抗体对细胞有毒性，会影响细胞活性；并且在半固体培养基上筛选出的高产细胞，转移到悬浮培养系统可能并不高产。流式细胞术的分选效率高，但是由于流式细胞术分选采用的内部压力及其高频震荡对细胞造成的损伤较大，分选下来的细胞活性不高。筛选过程对细胞的物理或化学损伤是造成细胞单克隆率降低的原因之一，除此之外，筛选前细胞的状态对于筛选后是否形成高产的细胞群落也很重要，若是筛选前细胞状态已经不好，筛选后其状态也难以变好，何况筛选过程会对细胞造成一定的损伤，更不会奢望其状态会变好。

综上所述，寻找一种分选效率高，筛选出的阳性克隆细胞成活率高、生长率高，且单克隆源性证据可追溯的筛选方法或技术平台对于涉及单克隆细胞筛选的基因治疗、抗体等生物医药行业显得尤为重要。

德国 Cytena 公司开发的单细胞打印机（SCP）采用的芯片包含**的硅膜设计，电子控制的制动板轻轻挤压腔体导致腔体体积变小，产生液滴，通过高分辨率的CCD相机确认只含一个细胞且该细胞直径和细胞圆度符合设定范围的液滴落进96/384孔板中，不含细胞的空液滴和含两个及以上细胞的液滴被气动阀门吸走。通过设定细胞直径和细胞圆度的质控分选过程，不仅提高了单细胞的分选效率，也筛选到了状态更好的细胞，提高了单克隆细胞的生长率。

图1. Cytena 单细胞打印机工作原理图

单细胞的证据可追溯性，在cartridge分离细胞前后的过程中，会连续拍取多张细胞图片，证实克隆来自于单个细胞。

图2. cartridge分离细胞前后的过程图 

Cytena单细胞打印机进入国内以来，受到国内各大药企的青睐，得到了众多用户的的积极反馈和认可。

具体案例分享

一、下面给出了不同地区一些客户反馈的单细胞克隆成活率及单克隆细胞拍照图。

图3. 不同客户使用Cytena单细胞打印机得到的单细胞克隆成活率数据

（1）杭州客户

（见下图）左图为单细胞打印机分选后Day14天拍照图， 右图为有限稀释法分选后Day14天拍照图。

结论：SCP分选出的细胞几乎都是单细胞，有限稀释大部分都是空孔。SCP长出来的单克隆数（70个）几乎是有限稀释的4倍（18个）。

（2）南京客户

一共分选2组样品，在有限稀释法分选很难生长的细胞，通过SCP分选后，都获得了66-75个单克隆细胞株，证实SCP通过细胞直径，细胞圆度等质控方式能筛选到状态好的细胞，提高单克隆率。

（3）上海客户

单细胞打印机分选的 96 孔板最终获得的克隆数目是有限稀释法的 4.3 倍。

（4）东北客户

SCP的分选效率高（如下图所示），除了周边孔受到蒸发效应影响生长，中间的孔都是单克隆来源的细胞，且生长良好。（细胞类型：CHO细胞）

（5）成都客户

根据统计，一块384孔板除去阳性对照孔，一共对378个孔进行了单细胞分选（统计结果见下表），对分选过程中的喷嘴成像、3D全孔成像以及后续的底板成像进行评估，喷嘴成像显示得到单细胞孔378个，即单细胞率100%；3D全孔成像显示得到的单细胞孔374个，即单细胞率98.9%;这也充分表明喷嘴成像和3D全孔成像可以相互佐证，使我们的单细胞率的正确率无限接近100%；生长7天后，330个孔成功生长成单细胞克隆团，单克隆率为88.2%。

二、客户评价