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使用CESI-MS技术分离检测单克隆抗体的蛋白亚型以及抗体的纯度

作者:北京昊诺斯科技有限公司 2016-08-19T15:32 (访问量:4667)

使用CESI-MS技术分离检测单克隆抗体的蛋白亚型以及抗体的纯度

 

引言
 
免疫球蛋白(IgGs)是制备治疗性单克隆抗体(mAbs)过程中最常见的分子。运用高灵敏度的检测手段全面研究这些分子的性质,对于抗体药物的开发、药效控制、生物利用度以及安全性而言是必不可少的。近几十年来,对于完整的单克隆抗体以及还原的单克隆抗体的分析已成为生物制药产业的标准技术,并且这些研究工作逐渐向CESI™平台延伸。我们利用CESI-MS技术在一次分析过程中,同时获得完整或者还原的单克隆抗体的电荷异质性、纯度以及分子量等信息。分析结果与CE-SDS以及毛细管等点聚焦(cIEF)的分析结果是相吻合。CE-SDScIEF是目前工业中认可的两种分析单克隆抗体药物的方法。

CEMS分别是单克隆抗体的电荷异质性、纯度以及分子量表征的重要方法。而将CEMS结合起来,我们就可以将单克隆抗体的电荷异质性、纯度以及分子量等几种表征结合到一次分析中来完成。此外,高分辨的质谱检测技术可以帮助我们鉴定未知的CE峰。相对于光学检测,也可以获得更为准确的纯度信息和分子量信息。
 
CESI技术是将CE与电喷雾整合在一个过程当中,同时也降低了质谱分析对样品的要求。在这部分工作中,我们使用CESI-MS技术同时测定了单克隆抗体的电荷异质性、纯度以及分子量等信息。为了实现这一目的,我们使用CESI-MS技术以及其他基于CE的技术对完整的和还原的IgG1IgG2以及IgG4进行了分析。
 

 

CESI-MS技术分析单克隆抗体的电荷异质性采用的是CZE的模式,结果和采用cIEF方法的结果是一致的1-3。蛋白的翻译后修饰,例如糖基化修饰引起电荷异质性,这些异构体在电泳中的迁移时间有所不同。电荷异质性分离中的另外一些峰也可能是样品中存在的杂质。此外,在基于CZE测定单克隆抗体电荷异质性的实验中使用质谱作为检测器的优势在于:可以同时获得分子量以及样品的纯度的信息。
 
 
CESI 8000 Triple TOF® 6600联用。使用的离子源型号是Nanospray III,毛细管是中性涂层毛细管。
 
 
实验材料和方法

样品制备:在CESI-MS技术的实验中,IgG1IgG2以及IgG4的溶液(浓度为20 mg/mL)使用脱盐柱(Thermo Fisher Scientific)脱盐,然后溶解在50mMpH 4)的醋酸铵溶液中。IgG的还原是向IgG的溶液中加入10 mM的 二硫苏糖醇和0.1%Rapigest SF表面活性剂(Waters),然后在60 ℃下恒温45分钟。加入0.5 %的甲酸,37 ℃恒温10分钟,将Rapigest切断,随后加入沉淀剂将Rapigest去除。然后向溶液中加入高浓度(2 MpH 4)的醋酸铵使其终浓度为50 mM。单独使用CE时,IgG分子被溶解在两性电解质的溶液中(cIEF)或者SDS的凝胶溶液中(CE-SDS)。在SDS凝胶溶液中的还原反应是在60 ℃下进行的,加入10 mM二硫苏糖醇,恒温10分钟。
 
 
CESI 8000单独进行毛细管电泳时的条件:CE-SDScIEF的实验使用的SCIEX PA 800 Plus的试剂盒和操作流程。

CESI 8000与质谱联用时的条件:CESI的实验使用的仪器是SCIEX CESI 8000 Plus系统。该系统具有控温的自动进样系统,最大电压为30 kV的高压系统。使用的毛细管是中性涂层毛细管,毛细管的尖端经过腐蚀形成一个电喷雾的喷口。分离过程中的缓冲溶液和导电溶液是3%的醋酸。进样压力为5 psi,进样时间为10 s,进入毛细管的样品体积约为7.5 nL。由于样品是溶解在50 mM的醋酸铵中,因此在进样之后会有一个瞬态的等速电泳过程将样品进行堆积。预分离过程中,分离条件为:电压30 kV,压力2psi,分离时间为7 min。然后将压力增大到10 psi分离10 min,并进行电喷雾。
 
 
质谱条件:CESI 8000 Triple TOF®6600联用,使用的离子源型号是Nanospray III,连接CESI的适配器。完整蛋白的扫描范围为400-4500 m/z
 
数据处理:处理高分辨的质谱数据使用的软件是SCIEX PeakView®BioPharmaView™
 
 
 

结果与讨论
 
CESI-MS技术对单克隆抗体的分析使用的是中性涂层的毛细管,分别测定了非还原以及还原的样品。非还原的IgG1经过CZE的分离(图1),获了它的电荷异质性信息,同时也准确地测定了不同异构体的分子量,此外根据去卷积的结果也鉴定了样品中的杂质。我们检测到了两类主要的的IgG1,含量高的一类IgG1的平均分子量是146900 Da,另外一种酸化的IgG1的平均分子量为151005 Da。除了分子量的不同,它们的糖型也不相同。经过对去卷积的结果进一步处理,能够促进我们对氨基酸序列和糖型的测定。通过质谱我们检测到了另外两种类型的IgG1,它可能是样品处理过程中产生的杂质。IgG1的杂质里包含了大量的分子量为286083668746585的分子。杂质中最大分子量为100545,与重链-重链二聚体的分子量和糖型是一致的。
 
 
 
1.使用质谱对lgG1的电荷异质性进行检测。图为非还原型lgG1
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