禽白血病病毒J亚群(ALV-J)属于逆转录病毒属,慢病毒亚科的家族成员,可引起禽类多种肿瘤性疾病,如骨髓细胞瘤、肉瘤、血管瘤、肾肿瘤和成红细胞增多症,以及禽类骨髓白血病,导致受感染鸡的高死亡很率。该分散的ALV-J菌株分布广泛,既能水平传播又能垂直传播,往往造成禽类养殖领域的巨大经济损失。目前我们对ALV-J诱导的肿瘤发生机制仍不清楚,导致根除ALV-J带来的损害仍然是一项重大挑战。
近日,云序客户华南农业大学的谢青梅研究团队利用云序生物提供的环状RNA测序、RIP和RNA pull down等技术手段首次揭示了感染了逆转录病毒ALV-J的家禽鸡显著上调的circ-Vav3通过海绵吸附gga-miR-375的作用来上调靶基因YAP1的表达,从而促进肝肿瘤的发生。该研究成果以“Circular RNA Vav3 sponges gga-miR-375 to promote epithelial-mesenchymal transition”为题发表在《RNA Biology》(IF: 5.216)。值得注意的是,该研究团队前期已经利用云序生物提供的环状RNA测序服务成功发表了一篇ALV-J病毒抗性与病毒易感的鸡肝脏组织当中环状RNA表达表达谱的文章(Circular RNA alterations are involved in resistance to avian leucosis virus subgroup-J-induced tumor formation in chickens),发现了32个差异表达的环状分子,其中12个在ALV-J抗性样本中表达量显著升高,而20个在易感样本中表达量更高,而生信预测表明这些环状RNA分子能够调控免疫分子通路的信息传递从而改变生物体的免疫力。此次又与我司深入合作,利用RIP和RNA pull down技术阐明了其通过海绵吸附的调控作用来促进肝肿瘤的形成。真正实现了从环状RNA表达谱至功能机制研究的完美进阶,为其他物种或疾病类型的研究提供了不错的参考。
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该团队先前的研究揭示gga-miR-375在禽类白血病病毒J亚群(ALV-J)感染的鸡肝脏肿瘤中表达显著下调。结合当下的研究热点认为gga-miR-375可能与circRNA有关。在本研究中,环状RNA测序结果显示,在感染ALV-J的鸡肝脏肿瘤中,circ-Vav3显著上调。进一步通过RIP、生物素RNA pull down和RNA-FISH实验证实circ-Vav3是gga-miR-375的海绵。此外,研究者通过双荧光素酶报告基因检测证实YAP1是gga-miR-375的靶基因,并且进一步验证了circ-Vav3通过海绵吸附作用释放gga-miR-375的靶基因YAP1,进而通过circ-Vav3/gga-miR-375/YAP1轴影响上皮间质转化(EMT)过程以促进肿瘤的发生,并在临床样本中得到了验证。
研究内容:
1.circRNA表达谱及其结合位点预测
研究人员以ALV-J感染的鸡肝为测序样本,通过环状RNA测序(由云序生物提供)检测到有2822个circRNAs呈现差异性表达,其中2808个circRNAs显著性上调。并通过聚类图、火山图和散点图对25种表达上调的circRNAs进行生信分析,发现circ-Vav3上调最显著。此外,该团队先前的研究揭示了同样的样本中gga-miR-375下调最明显。接下来利用TargetScan和miRanda软件对25种circRNAs可能结合的miRNAs进行生信预测,结果显示其中circ-Vav3与gga-miR-375结合的评分最高。
2.circ-Vav3海绵吸附gga-miR-375
circ-Vav3的命名主要是基于该环状RNA来源于Vav3基因的8-11号外显子;预测结果显示circ-Vav3与gga-miR-375之间存在完美的靶向位点。利用海绵机制指示蛋白进行AGO2 RIP实验(由云序生物提供),对捕获的AGO2蛋白进行qPCR检测发现circ-Vav3与gga-miR-375显著富集;同时利用circ-Vav3探针进行RNA pull down实验(由云序生物提供)检测出了gga-miR-375的结合情况。RNA-FISH实验证实了circ-Vav3主要存在细胞质,而gga-miR-375即存在于细胞质又存在于细胞核,揭示了circ-Vav3和gga-miR-375通过相互结合发挥调控作用。
3.gga-miR-373 通过与YAP1的3’UTR区结合负调控YAP1的表达,并且过表达gga-miR-375可减弱EMT
生信预测揭示YAP1是gga-miR-375的潜在靶基因,进一步的双荧光素酶报告基因证实了gga-miR-375可通过结合YAP1的3’UTR区抑制YAP1的表达;在体外细胞系DF-1中过表达gga-miR-375可明显下调YAP1的mRNA和蛋白水平,揭示了gga-miR-375通过直接结合YAP1的3’UTR区,抑制YAP1基因的表达。EMT现象是肿瘤发生转移的前兆,该过程伴随着关键基因的上调(N-cadherin, Fibronectin, MMP2, ZEB1)和下调(E-cadherin)。通过过表达gga-miR-375发现可以显著上调EMT正相关的基因的mRNA和蛋白水平,下调负相关基因的mRNA和蛋白水平,并且证明了EMT相关基因并不是gga-miR-375的直接靶基因。所以gga-miR-375是通过抑制YAP1基因的表达间接抑制EMT的进程。
4.YAP1过表达促进EMT,使细胞迁移能力增强
研究者进一步通过Transwell实验证明了过表达YAP1可显著增强细胞的迁移能力,同时qPCR和WB也证实在YAP1过表达的DF-1细胞系中,EMT相关的关键基因表达情况发生了明显的改变,说明YAP1可促进EMT的发生和细胞迁移能力。
5.circ-Vav3海绵吸附gga-miR-375上调靶基因YAP1从而促进EMT
经过前期工作的积累,研究人员认为circ-Vav3在胞浆中海绵吸附gga-miR-375,从而上调YAP1和EMT相关基因的表达。共表达实验显示,相对于过表达gga-miR-375和LCDH-circ-EV(空载组),而过表达gga-miR-375和LCDH-circ-Vav3(实验组)的EMT正相关基因(Fibronectin, N-cadherin, MMP2, ZEB1和Vimentin)的蛋白和mRNA水平明显上调,而负相关基因(E-cadherin)的蛋白和mRNA水平明显下调;更加证实了circ-Vav3通过海绵作用吸附gga-miR-375,上调其靶基因YAP1的表达,进而诱导EMT的发生。
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