云序客户PNAS文章揭示2型糖尿病的潜在治疗靶标-技术前沿-资讯-生物在线

云序客户PNAS文章揭示2型糖尿病的潜在治疗靶标

作者：上海云序生物科技有限公司 2020-05-09T17:01 (访问量:3993)

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肝脏病学权威杂志Hepatology (IF=14.97)在线发表了一项最新研究成果：RNA甲基化在NAFLD发生发展中起着重要的作用。该文当中m6A-seq和RNA-seq由云序生物提供技术服务。据悉，复旦大学附属中山医院内分泌科团队长期致力于NAFLD的发病机制研究，在近期工作中系统性阐明了多个与肝脏代谢相关的分子机制（PNAS 2019、Diabetes 2018、 Diabetes 2017、Cell Metabolism 2016、JCI 2014、Gut 2014）。本期我们解析该课题组2019年10月应用云序生物的RNA-seq技术服务，发表在PNAS杂志（IF 9.58）上关于内质网应激对2型糖尿病影响的文章。

2型糖尿病的发病机制主要是胰岛素抵抗（IR）和胰岛β细胞功能受损，已有研究提出内质网应激（ERS）是导致糖尿病、IR和肥胖发生的主要途径。内质网应激是指由于某种原因使细胞内质网生理功能发生紊乱的一种亚细胞病理状态。多种因素可以打破内质网的稳态，导致蛋白质折叠障碍或错误折叠，进而触发内质网应激。适度的内质网应激会导致适应性的细胞保护作用，过高和持久的内质网应激则会激活特有的凋亡通路导致细胞凋亡。内质网应激通过影响胰岛细胞的功能，促使胰岛β细胞凋亡及参与胰岛素抵抗介导2型糖尿病的发生和发展。该研究显示了内质网应激诱导的葡萄糖稳态破坏的机制，并提出USP14作为针对T2DM的潜在治疗靶标。

发表期刊：Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

影响因子：9.58

发表时间：2019.10.22

实验方法：RNA-seq（本实验由云序提供）

文献链接：Sustained ER stress promotes hyperglycemia by increasing glucagon action through the deubiquitinating enzyme USP14

文章内容

（1）持续的内质网应激破坏瘦小鼠的葡萄糖稳态

为了确定持续的内质网应激对葡萄糖代谢的影响，研究人员通过小剂量衣霉素（LD-Tun）将瘦小鼠的慢性低度内质网应激诱导至与高脂饮食（HFD）喂养的肥胖小鼠相似的水平，发现低度内质网应激伴随着高血糖症、葡萄糖耐受不良和丙酮耐受不良（图1 A、B和C）。另外，LD-Tun处理后，肝葡萄糖生成的标志物PEPCK和G6Pase的表达显著升高， LD-Tun也上调了PGC-1α基因，该基因可共同激活糖异生转录因子（图1D）。但是，胰岛素敏感性、胰岛素刺激的AKT磷酸化以及空腹和餐后血浆胰岛素水平相对不受LD-Tun的影响（图1E和F）。

体内研究结果也发现，LD-Tun增加了小鼠原代肝细胞（MPHs）中的葡萄糖生成并上调了糖异生基因（图1 G和H）。综上所述，肥胖与慢性低度内质网应激相关，其通过破坏葡萄糖稳态增加肝糖原异生并导致高血糖症。

图1. 持续的内质网应激会诱发高血糖症和肝糖异生

（2）USP14介导持续的内质网应激的糖原生成作用

为了阐明持续的内质网应激对葡萄糖代谢的影响机制，作者通过RNA-seq（本实验由云序提供），比较了盐水和LD-Tun处理的肝脏组织。发现相对于对照小鼠，LD-Tun处理的小鼠肝脏中有超过1,131个基因表达发生了改变，其中792个上调基因和339个下调基因（FC＞1.5，P＜0.05），其中USP14表达改变显著。最近的研究表明，USP14可以调节肝甘油三酸酯的代谢。此外，USP14先前已被确定为IRE1α的结合伴侣，因此是UPR的潜在介体。因此，作者假设USP14在内质网应激相关糖异生中起作用。与假设一致，在接受LD-Tun治疗的小鼠肝脏中USP14明显上调（图2 A和B）。在LD-Tun处理的MPH中也观察到USP14的上调（图2 C和D）。化学伴侣蛋白牛磺去氧胆酸（TUDCA）对内质网应激的缓解大大减弱了LD-Tun诱导的USP14在MPHs中的表达（图2 E和F）。这些数据证明内质网应激的激活导致USP14的差异表达。

为了确定USP14的高表达在持续内质网应激调节葡萄糖代谢中是必不可少的，作者敲除了瘦小鼠中的内源性USP14（图2 G和H），发现LD-Tun对葡萄糖稳态和糖异生的影响减弱（图2 I–L）。综上表明，USP14介导持续内质网应激的糖原异生作用。

图2. 持续内质网应激的糖原异生作用需要USP14

（3）持续的内质网应激通过ATF4上调USP14

接下来，作者探究USP14是否是持续内质网应激的分子靶标。先前已证明ATF4是内质网应激通路的下游效应器，可触发细胞凋亡。作者在MPH中过表达ATF4后，发现USP14表达上调（图3 A和B）。突变ATF4后，减弱了LD-Tun诱导的USP14水平（图3 C和D）。在敲除肝ATF4基因的小鼠中，分离MPH后也观察到了相似的结果（图3 E和F）。萤光素酶报告基因检测表明，ATF4的过表达上调了USP14启动子的转录活性，并确定了ATF4与USP14启动子区域的直接结合。综上所述，这些发现表明持续的内质网应激可通过ATF4上调USP14。

图3. 持续的内质网应激通过ATF4上调USP14

（4）USP14刺激肝糖异生和葡萄糖输出

为了确定USP14是否足以改变肝糖代谢，作者向瘦小鼠体内注射野生型USP14（Ad-WT USP14）或其催化失活形式（Ad-CI USP14）的腺病毒（图4A）。与感染Ad-GFP和Ad-CI USP1的小鼠相比，过表达Ad-WT USP14后，显著增加了小鼠的血糖水平（图4B）。另外，感染Ad-WT USP14的小鼠葡萄糖耐受较差，肝葡萄糖输出增强（图4C和D）。同样的，在过表达WT USP14的小鼠中也诱导了糖异生基因（图4E）。在过表达Ad-WT USP14的MPH中也观察到了葡萄糖生成和糖异生基因表达的增强（图4 F和G）。因此，USP14对肝糖代谢有直接影响。

图4. 肝USP14的过表达引起高血糖症并促进糖异生

（5）抑制肝脏USP14可改善肥胖小鼠的葡萄糖代谢

前期研究表明肥胖与低度内质网应激有关，因此USP14成了控制肥胖相关高血糖的潜在靶标。作者用IU1（USP14的抑制剂）治疗高脂饮食（HFD）喂养的肥胖小鼠，14天后发现血糖水平降低以及糖耐受得到改善，并且肝葡萄糖和糖原异生基因的表达显著下降。敲除USP14后，获得了相似的结果（图5 A–D）。瘦素缺乏的小鼠肝USP14的消耗也改善了葡萄糖的体内稳态，并减少了糖异生（图5 E–H）。综上所述，USP14可以成功地改善肥胖小鼠的葡萄糖稳态。

图5. 抑制肝脏USP14可改善肥胖小鼠的葡萄糖代谢

（6）USP14通过提高胰高血糖素作用来增加肝糖异生

为了确定USP14的作用机制，作者分析了其对胰高血糖素和胰岛素的作用，胰高血糖素和胰岛素分别在禁食和进食状态下维持葡萄糖稳态。在糖尿病小鼠中，敲除肝脏中USP14基因后，显著减轻了高血糖症并下调了糖原异生基因。这些结果表明，胰岛素可能不介导USP14对糖异生的调节。相反，胰高血糖素耐受性测试表明，在过表达USP14的小鼠中注射胰高血糖素后，血糖水平明显升高（图6A）。此外，MPH中的USP14过表达和敲低分别增强和降低了胰高血糖素刺激的葡萄糖生成（图6 B和C），以及糖原异生基因的表达（图6 D和E）。接下来作者检查持续的内质网应激是否也以USP14依赖性方式增强了胰高血糖素的作用。胰高血糖素耐受性测试显示，与对照小鼠相比，LD Tun处理的小鼠的胰高血糖素刺激的血糖水平更高（图6F）。同样，LD-Tun显著增加了胰高血糖素刺激的葡萄糖生成，并且这一现象可通过敲除USP14减弱（图6G）。综上，USP14通过增强胰高血糖素的作用来促进糖异生和肝糖生成。

图6. USP14通过提高胰高血糖素作用来增加肝糖异生

（7）USP14提高CBP稳定性

USP14的催化功能对其糖异生作用至关重要，这一事实表明，USP14可以通过稳定后者的靶蛋白来促进胰高血糖素的作用。前期研究表明，循环系统中的胰高血糖素会增加细胞内cAMP的水平，从而触发cAMP依赖性蛋白激酶A磷酸化肝细胞中的CREB蛋白。CREB蛋白与糖异生基因CRE的启动子区域结合，并通过募集2种共激活因子（CRTC2和CBP）来激活它的转录。

作者推测USP14也是通过上述方式发挥作用，于是过表达USP14，发现肝脏和MPH中的CBP水平显著增加（图7A和B），但没有影响CREB和CRTC2的水平（图7A）。与相应的对照小鼠相比，经LD-Tun治疗的小鼠和肥胖小鼠的肝脏中CBP水平也显著提高（图7C-E）。敲除USP14后，这些小鼠中CBP蛋白质表达水平显著降低（图7 F–H）。但是，CBP的mRNA水平没有受到影响（图7I），表明USP14在翻译后水平上调节CBP的稳定性。

同样，在过表达USP14或经LD-Tu处理的MPH中，CBP的半衰期增加了（图7J和K），而敲低USP14则加速了CBP的降解（图7L）。此外，MPH和小鼠肝脏中的共免疫沉淀法证实了USP14和CBP之间存在直接的相互作用（图7 M和N）。为了测试这种相互作用是否可以抑制CBP泛素化，将Flag标记的CBP，His标记的泛素和血凝素标记的CI USP14或WT USP14质粒共转染到HEK293T细胞中。结果发现CBP泛素化增多，而共表达WT USP14可显著抑制泛素与CBP的结合（图7 O）。相反，内源性USP14的敲除显著增强了MPHs中内源性CBP的多聚泛素化作用（图7 P）。此外，LD-Tun治疗减少了MPHs中CBP的泛素化（图7Q， lane 2 vs. lane 1）。相反，即使在存在LD-Tun的情况下，内源性USP14表达的敲除也显着增加了CBP的泛素化（图7Q，lane 3 vs. lane 2），而USP14的过表达则可以逆转这种现象（图7 Q，lane 4 vs. lane 3）。综上，USP14是LD-Tun诱导的CBP去泛素化所必需的。总的来说，这些数据表明USP14结合CBP并阻止其泛素介导的降解，从而提高CBP稳定性。

图7. USP14提高CBP稳定性

文章总结

总体来说，作者通过RNA-seq（本实验由云序提供），找到糖代谢的关键基因USP14，并发现USP14可增强肝糖原异生从而促进高血糖症。并且持续的内质网应激上调了USP14，从而增加了cAMP反应元件结合蛋白CBP的稳定性，从而增强了胰高血糖素的作用和肝糖异生。肝脏中USP14的过表达显著增加了肝葡萄糖输出。USP14的肝脏特异性敲除消除了内质网应激对葡萄糖代谢的影响，并且改善了肥胖小鼠的高血糖症和葡萄糖耐受不良。以上研究结果揭示了内质网应激导致葡萄糖稳态破坏的机制，并提出USP14可作为针对2型糖尿病的潜在治疗靶标。

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