Hieff Clone^TM实验流程：
    Hieff Clone^TM一步法同源重组快速定向克隆试剂盒分为单片段克隆和多片段克隆试剂盒，实验流程见下图1。


 

图1：Hieff Clone^TM一步法快速定向克隆试剂盒进行单片段和多片段克隆实验流程图。

①线性化载体的制备：酶切或PCR制备线性化载体。②插入片段的制备：在目的DNA片段上下游引物的5’端引入20 bp左右末端同源序列；PCR反应扩增目的片段。③重组反应：按比例混合线性化载体和目的DNA片段进行重组，50℃反应20 min。④转化、涂板：将重组产物直接转化后涂平板。挑取克隆。

产品实例：
1.单片段高效重组克隆

图2：Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit可以有效克隆不同长度的单片段基因。A-D：重组转化平板。E：插入片段和载体浓度检测电泳图。F-H：插入片段PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分别是1.2 kb，3 kb和5 kb，载体量：100 ng/20 μl反应体系，载体与插入片段摩尔比：1:3，反应条件：50℃，20 min。

2. 多片段轻松重组克隆

图3：Hieff Clone^TM Plus Multi One Step Cloning Kit进行三片段克隆。A：重组转化平板。B：插入片段和载体浓度检测电泳图。C：PCR方法鉴定每个单片段和最终连接基因。箭头指示目的条带。载体：pCAMIBA1302，10 kb，三个插入片段长度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，载体量：160 ng/20 μl反应体系，重组反应条件50℃，20 min。

3. 载体与插入片段摩尔比1:3左右最适

图4：Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit试剂盒单片段和载体不同摩尔浓度比例重组克隆测试。A-C：重组转化平板。载体与插入片段的分子摩尔数比分别是1:2（A），1:3（B）和1:4（C），重组反应条件50℃，20 min。

4. 重组反应时间20-30 min最佳
        
图5：Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit试剂盒不同重组反应时间克隆测试。A-C：重组转化平板。重组反应时间分别是20 min（A），25 min（B）和30 min（C），重组反应温度50℃。

客户案例展示：
1.超高的阳性率

客户单位：中国科学院植物生理生态研究所
图6：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit进行克隆，阳性率100%。A：重组转化平板。B：克隆基因PCR鉴定电泳图。载体：10 kb，插入片段：300 bp，载体浓度：50 ng/μl，插入片段浓度：50 ng/μl，载体与插入片段摩尔比例为1:1，重组反应条件50℃，20 min。

2.低浓度载体重组

客户单位：西南大学
图7：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit进行克隆。A：重组转化平板。B：载体浓度检测电泳图。C：插入片段浓度检测电泳图。D：克隆基因PCR鉴定电泳图。箭头指示目的条带。载体4.7 kb，插入片段1.6 kb，载体浓度：5 ng/μl，插入片段浓度：25 ng/μl，载体与插入片段摩尔比例为1:2，重组反应条件50℃，20 min。

3。超高性价比

图8：Hieff Clone^TM Plus Multi One Step Cloning Kit与不同品牌的同类产品相比，显示出更高的性价比。

FAQ

Q1：Hieff Clone^TM克隆的原理是什么？

A1： 利用末端同源重组的原理。将任意线性化载体和具有与其两端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。

Q2：与传统克隆相比，Hieff Clone^TM克隆有什么优势？

A2：1）无需考虑酶切位点：不受目的DNA片段限制性酶切位点的限制，适用于任何载体。

2）设计简单：在目的片段的PCR扩增引物5’端引入20 bp左右与载体末端同源的序列即可。

3）快速高效：50℃，20 min即可完成重组反应。克隆阳性率可达95%以上。

4）无缝克隆：插入位点不会引入额外的碱基序列。

Q3：同源序列长度对重组效率的影响？

A3：同源序列的长度与克隆数目有相关性，一般同源片段选择在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范围内调整。并且选择尽量避免出现二级结构。

Q4：线性化载体和目的片段产物的质量会影响重组反应吗？

A4：线性化载体或目的片段品质较差时会极大影响重组反应，建议割胶回收纯化产物。

Q5：一步法快速定向克隆试剂盒对感受态细胞有要求吗？

A5：推荐使用转化效率为10⁸ cfu/μg的感受态细胞。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES），TOP10（cat NO. 11801ES）等。

Q6：线性化载体和目的片段扩增产物的使用量和比例？

A6：载体使用量应大于0.01 pmol，推荐使用量0.03 pmol；克隆载体与目的片段摩尔比应在2:1-1:5范围内，最适为1:2-1:3，超过范围可能会影响克隆效率。

Q7：一步法快速定向克隆试剂盒适用实验有哪些？

A7：本试剂盒适用于绝大多数基于常规“酶切-连接”方法的克隆实验，并且特别适用于其它常规方法难以快速实现的基因多点突变、全基因合成等。

Q8：多片段一步法快速定向克隆试剂盒可以用于单片段的克隆吗？

A8：多片段一步法克隆试剂盒可以用于单片段的克隆。但是，单片段克隆试剂盒不建议用于多片段的克隆，重组效率可能会受到影响。

Q9：一步法快速定向克隆试剂盒反应温度是50℃，是否可以在37℃进行反应？

A9：一般情况下建议在50℃进行反应。50℃