登革热病毒（DENV）是一种由蚊子传播的黄病毒，是目前困扰全世界热带和亚热带国家的最严重的虫媒病毒。DENV在人类和伊蚊之间的维持它的生命周期，尤其是埃及伊蚊和白纹伊蚊。蚊子可能偶然以病毒宿主为食，获取含有DENV颗粒的血液，这些病毒颗粒会被转移到蚊子的中肠。病毒随后感染蚊子肠上皮，然后传播到其他组织，例如血淋巴和唾液腺，以致被感染的蚊子能够通过血液将病毒传播给其他宿主。蚊子在吸血过程中将病毒宿主的大量血液吸入肠道，这是蚊子感染DENV的主要方法。宿主血液在吸血几天内被蚊子机体消化和代谢的同时使得肠道上皮获病毒感染。这表明血液成分或其代谢产物可以直接调节肠道上皮的免疫和生理状态，从而调节蚊子对病毒的易感性。

实际上，宿主血液中的许多因素都可能会调节病原体对蚊子的感染。例如，疟原虫通过脊椎动物宿主传播到蚊子，其配子体在蚊子中肠内进行有性生殖阶段的发育成熟，而宿主血液中的许多因素在配子体的发育中起作用。虫媒病毒对蚊虫中肠的感染也受宿主血液成分的调节。宿主免疫应答的变化，例如提高抗DENV包膜蛋白的免疫球蛋白滴度，可能会调节埃及伊蚊从蠕虫病患者获得DENV的能力。吸食血液时，人血中的低密度脂蛋白会被埃及伊蚊的肠上皮细胞吞噬并积聚在肠上皮中，从而阻碍了DENV感染埃及伊蚊。此外，通过血液消化产生氨基酸谷氨酸可激活涉及神经递质GABA（γ-氨基丁酸）的信号，从而促进蚊子的免疫抑制，进而促进从吸食的血液中获得病毒。除宿主血液成分外，黄病毒还可以利用其自身的非结构蛋白（NS1），这些蛋白分泌到宿主血液中可有效地克服蚊子的肠道的不利环境，从而实现病毒的获取。然而，宿主个体之间的血液成分可能会根据其遗传，生理和营养状况而有很大差异。

据此，清华大学医学院，清华大学-北京大学生命科学联合中心程功教授，提出血液成分的变化可能是调节蚊子对DENV敏感性并确定蚊子传播的DENV能力的外在因素的这一假设。该研究团队通过对人血清铁在埃及伊蚊对DENV的吸收方面的影响、小鼠血清铁水平及铁缺乏症小鼠中的补铁在蚊子对DENV的获取的影响等试验，对这一假设进行验证。该研究结果发现，在体外和体内模型中，血清铁的非血红素结合形式在蚊子肠中正调控抗病毒ROS的产生。蚊子铁代谢利用从人血中获取的铁来下调肠道上皮中抗氧化剂基因的表达，从而导致强大的ROS反应。该项研究结果对蚊子吸食血液激活的ROS提供了一个机制上的见解。该研究成果已发表在Nature Microbiology期刊上，IF=14.174。博士后朱毅斌为第一作者，程功教授为该文章的通讯作者。

题目：

Host serum iron modulates dengue virus acquisition by mosquitoes

期刊：Nature Microbiology

影响因子：14.174

PMID：31527795

第一作者：

博士研究生朱毅斌

作者单位：清华大学医学院

索莱宝合作产品：

吸血是蚊子感染虫媒病毒的主要途径。血液代谢物成分可以调节蚊子对虫媒病毒的敏感性。该研究报告了人类血液中的血清铁对蚊子获取登革热病毒的影响。埃及伊蚊对登革病毒的感染率与供者血清铁浓度呈负相关。在小鼠-蚊子获取模型中，补铁可降低登革病毒感染率和病毒载量，而中和血清铁可促进埃及伊蚊的登革病毒感染。值得注意的是，以缺铁（铁缺乏症）小鼠为食的蚊子出现较高的登革热病毒感染率。宿主缺铁状态的逆转在很大程度上减少了蚊子对登革热病毒的获得和感染。蚊子的铁代谢途径利用的是血清铁而不是血红素结合铁，从而提高了肠道上皮中活性氧的活性，进而抑制登革热病毒的感染。根据这些结果，人群中缺铁的状况可能有助于对登革热病毒的矢量放纵，从而促进其通过蚊子传播。

1、人血清铁抑制埃及伊蚊对DENV的吸收

随机收集了60份人类血液样本，通过体外血液喂养系统向埃及伊蚊喂食含有人类血液和DENV-2感染的Vero细胞上清液的混合物对这一个假设进行研究。结果表明人类血液的质量和成分可以调节蚊子对DENV的吸收。接下来检测了供体血清样本中的12种基本血液成分，并评估它们与蚊子中DENV含量的相关性。铁浓度与埃及伊蚊的DENV-2感染呈负相关。通过用去铁胺（DFX）（一种结合并从血清中去除铁的化合物）来特异性中和人血样品中的血清铁，从而增加了埃及伊蚊的DENV感染率。口服柠檬酸铁铵（FAC）（一种常用的铁补铁试剂）进行治疗，体外喂养血液或DENV-2感染的Vero细胞对埃及伊蚊的感染率均降低。相反，口服DFX治疗会增加埃及伊蚊的DENV患病率和病毒载量。

在生理条件下，血浆中循环的无机铁主要与运铁蛋白结合。该研究的人血清样本中的转铁蛋白饱和度值均低于70％，这表明血样是从具有稳定的铁的供体中采集的。该研究团队预测这些血液样本中会存在非转铁蛋白结合的无机铁。因此，他们通过口服接种含铁人转铁蛋白（全转铁蛋白），重新评估了血清铁在蚊子的DENV感染中的作用。与FAC治疗的结果一致，口服转铁蛋白的埃及伊蚊降低了DENV的患病率和病毒载量。

与血清中的铁相反，红细胞中的大多数铁与血红素结合。值得注意的是，埃及伊蚊的血红素铁浓度与DENV流行之间没有显著相关性。血清铁和血红素铁是通过蚊子中不同的途径被利用，从而导致不同的生理结果。他们评估了血红素在蚊子中DENV感染的作用。与血红素一起孵育对感染细胞中的病毒载量并没有影响。接下来，他们研究了血红素在DENV蚊子感染中的作用。蚊子直接暴露于血红素中可导致DENV流行程度的轻度降低，这表明人血中的血红素铁可能在调节DENV对蚊子感染中没有显著作用。

2、小鼠血清铁水平影响蚊虫对DENV的获取

接下来，他们利用小鼠-蚊子捕获模型来评估血清铁在蚊子捕获DENV中的作用。AG6小鼠（一种缺乏I型和II型干扰素受体（ifnagr-/-）的C57BL / 6小鼠）已被用作DENV感染的动物模型。在这里，AG6小鼠皮下感染DENV。接种病毒两天后，感染的小鼠受到埃及伊蚊叮咬15分钟。然后立即给小鼠静脉内注射全铁转运蛋白作为铁的补充剂。留置15分钟使铁在血液中扩散，然后将经过治疗的小鼠再次被蚊子叮咬。两个连续叮咬之间的时间短暂，可避免蚊子在吸食血液中获取病毒颗粒数量的变化。全转铁蛋白接种后，小鼠血清中的铁浓度显着增加，而病毒在此短时间内没有变化。在全转运铁蛋白治疗的小鼠中，埃及伊蚊的DENV感染率和病毒载量大大降低。

接下来，他们评估了小鼠循环中血清铁的消耗是否会改变DENV的获取。静脉内接种DFX可以从受感染小鼠的血清中去除铁，而这种治疗并不能改变小鼠的DENV病毒血症。以DFX处理和感染的小鼠为食的蚊子中DENV的患病率比以模拟治疗感染小鼠为食的蚊子高得多，这表明血清铁不会影响宿主体内DENV病毒血症的水平，但会通过吸食血液影响蚊子获得DENV。

3、蚊子的铁代谢途径通过活化肠道上皮中活性氧的活性抑制了DENV的感染

蚊子吸收铁的两个主要来源是血清和红细胞中的血红素。食物中的血清铁与蚊子中的转铁蛋白结合并被运输到蚊子细胞中。此外，血清铁可以通过二价金属转运蛋白1（DMT1）或其他未知转运蛋白导入昆虫肠道上皮。除血清无机铁外，溶血也导致细胞外血红素和血红蛋白的存在。人血浆中的血红素可能通过称为血红素载体蛋白1（HCP1）的转运蛋白转运到细胞中。血红素也可以与血红蛋白形成复合物，然后转运到细胞中。血清中的血红蛋白与结合珠蛋白相互作用，用于下游铁代谢。随后，血红蛋白和血红蛋白血红素加氧酶1（HO1）在细胞内进行处理，释放出无机铁以进行循环利用。通过这些途径从血液中获取的铁可能被存储在蚊子细胞的铁蛋白中。在埃及伊蚊中，DMT1、血凝蛋白或结合珠蛋白的人类基因没有同源性；然而，在埃及伊蚊中已鉴定出人类转铁蛋白（AaTransferrin），铁蛋白（AaFerritin）、HCP1（AaHCP1）和HO1（AaHO1）基因的同源基因。接下来，他们研究了铁蛋白在DENV感染中的作用。沉默埃及伊蚊铁蛋白H（AaFerritin H）基因可减少DENV复制；而伊蚊铁蛋白H（AaFerritin H）的异位表达会增加Aag2细胞中的病毒载量。敲除伊蚊铁蛋白H（AaFerritin H）基因可降低DENV对埃及伊蚊的感染。

接下来，他们评估了这些蚊子转铁蛋白在DENV获取中的作用。在埃及伊蚊基因组中鉴定到四个铁转蛋白（AaTransferrin）基因。沉默单个铁转蛋白基因（AaTransferrins）可适度增强蚊子的DENV感染；同时敲除这四个基因导致埃及伊蚊中更高的DENV感染率和病毒载量，表明这些铁转蛋白基因（AaTransferrins）在蚊子铁代谢中具有协同作用。他们接下来在果蝇表达系统中表达和纯化铁转蛋白基因（AaTransferrin）。口服这种转铁蛋白可以减少蚊子的DENV载量。

血红素中的铁或许可以被运输到蚊子细胞中，然后由血红素加氧酶释放，以通过蚊子的铁代谢进行再循环。因此，他们推测血液降解产生的血红素可能被HCP1转运到蚊子细胞中，而铁可能被HO1在到细胞内循环利用。但是，沉默AaHCP1或AaHO1基因不会影响埃及伊蚊中DENV感染和的活性氧（ROS）的积累。血红素代谢系统在蚊子体内的功效很低，表明血红素铁可能在调节DENV感染中没有重要作用。

接下来，他们研究了血清铁抑制蚊子获得DENV的机制。解剖经FAC处理或未经FAC处理的人血喂养的蚊子中肠，进行RNA测序（RNA-seq）分析。选择免疫信号成分，酶和效应物进行分析。

在用FAC处理的人血喂食蚊子后，29个基因的表达水平在24h时改变了4倍以上，51个基因在48h时改变了4倍以上。经FAC处理的血液喂养的蚊子中肠和对照组蚊子的中肠的RNA干扰，Toll，免疫缺陷和Janus激酶信号转导和转录激活剂（JAK-STAT）信号传导途径以及编码抗菌肽（AMPs）的基因水平均没有显著差异。然而，根据RNA-seq分析的结果，在埃及伊蚊的肠上皮中，多种埃及伊蚊过氧化氢酶（AaHPX）和超氧化物歧化酶（AaSOD）基因的表达被全面下调了4-13,000倍。用定量PCR方法验证了这些基因在喂血48h后的变化。实际上，HPX和SOD都作为调节因子，通过去除由产生ROS的酶和代谢活性合成的过量ROS来阻止ROS活性。ROS的激活是限制蚊子中DENV感染的关键。因此，他们推测从人血清中获得的铁可能会降低这些H2O2分解酶的表达，从而增加ROS的活化。剔除这些基因会严重影响DENV对埃及伊蚊的感染。沉默AaHPXs和AaSODs可以增加ROS的活性。此外，通过口服FAC补充可提高埃及伊蚊肠道中ROS的活性，而对AaFerritin H基因的抑制可以增强蚊子上皮细胞的ROS反应。FAC介导的补铁通过ROS激活提高了蚊子对DENV感染的抵抗力，而用乙酰半胱氨酸抑制ROS活性可恢复FAC处理过的蚊子的DENV载量和ROS活性。他们评估了口服人体单个血液样本的蚊子中肠的ROS反应。人血清中的铁浓度与肠道上皮中的ROS活性呈正相关，表明血清铁通过诱导蚊子肠上皮中的ROS活性而阻碍DENV复制。

4、铁缺乏症小鼠中的补铁降低了蚊子对DENV的获取

铁缺乏症是登革热流行国家常见的公共卫生问题。因此，他们评估了铁缺乏状态是否可以调节蚊子中DENV的发病率。首先，他们建立了长期缺铁AG6小鼠模型。用无铁饮食喂养AG6小鼠五周。正常饮食的小鼠充当模拟对照。食用无铁饮食后，粪便和血清中的铁浓度逐渐降低。接下来，他们用DENV-2皮下感染AG6小鼠。DENV-2感染后第1天至第5天，感染的小鼠每天受到蚊子叮咬（云南瑞丽毒株）。与以正常饮食喂养的小鼠相比，无铁饮食不会影响DENV病毒血症。以铁缺乏小鼠为食，可提高埃及伊蚊的DENV患病率和病毒载量。接下来，他们又利用Aegypti Mengla毒株（另一个田间蚊子群）进一步研究宿主铁在调节蚊子中DENV感染中的作用。小鼠的无铁饮食对DENV病毒血症没有显着影响。小鼠铁缺乏的状况促进了埃及伊蚊通过吸食血液获得DENV。

接下来，他们研究了缺铁小鼠中补铁是否可以通过田间蚊虫来调节DENV的获取。他们通过脚垫将DENV-2皮下注射感染了缺铁的AG6小鼠。每天向感染的铁减少症小鼠静脉内注射FAC或PBS，然后使其受到蚊子叮咬。补铁可增加小鼠血清中的铁浓度。小鼠病毒血症不受FAC处理的调节。铁缺乏症小鼠血清铁浓度的升高降低了蚊中肠和唾液腺的DENV患病率。他们将埃及伊蚊门格拉株与铁缺乏症小鼠用于随后的研究。小鼠血清铁浓度的增加会降埃及伊蚊门格拉株的DENV患病率和全身及唾液中的病毒载量。

他们评估了补铁对蚊子在低铁人类血液样本中对DENV获取的调节机制。人血清中的正常铁浓度范围从大约0.5到2.5μgml^-1。选择了十八份血清铁浓度低于0.55μgml^-1的血液样本进行研究。血清中的铁浓度分别增至1.5μgml^-1和μgml^-1。血清铁浓度的升高以浓度依赖性的方式降低了蚊子的DENV患病率。血清铁浓度增加至2.5μgml^-1完全消除了以五个血样为食的蚊子对DENV的获取，这表明宿主体内铁缺乏症的改善可能会降低蚊子对DENV的传播。

本研究团队通过一系列试验筛选，首次发现宿主血清中铁离子含量与蚊虫吸血获取病毒的能力呈高度负相关关系，首次证明宿主血清铁离子浓度是阻抑蚊虫获取病毒感染的关键负调控因素。进一步研究结果显示，血清中铁离子进入蚊虫肠道后，可被肠道细胞的铁代谢系统直接利用，抑制细胞内的抗氧化酶基因表达，导致蚊虫肠道中活性氧(ROS) 水平大幅提高，最终阻抑病毒在蚊虫体内的感染扩增。该研究结果揭示向登革病毒疫区的人群中普遍补铁是切断登革病毒在自然界中传播的一种有效手段，补铁将为登革病毒防治提供全新的防控思路和策略。

备注

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