嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞治疗技术近年来在临床上不断取得突破，特别是靶向CD19的CAR-T细胞在治疗B细胞来源的血液肿瘤上取得了令人瞩目的成果，使其成为了当下CAR-T细胞治疗中最热门的靶点。在CD19 CAR-T细胞开发生产过程中，CD19 CAR表达情况的检测是关键环节，目前，针对CD19 CAR的检测多采用聚合酶链反应和流式细胞术。
下面，小编就以今年2月MacLeod et al.在Molecular Therapy发表的一篇关于基因编辑同种异体CD19 CAR-T制备方法优化的文章（Integration of a CD19 CAR into the TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR T Cells）为例，为大家简要解读如何利用流式细胞术检测CD19 CAR-T细胞。
首先，我们来了解一下文章中CD19 CAR-T细胞的构造。 CD19 CAR-T细胞的核心部件为CD19 CAR，主要由CD19的单链抗体（克隆号：FMC63）片段（ScFv）、CD8a的铰链和跨膜区、共刺激分子4-1BB和CD3ζ胞内信号区串联而成（见图1）。
图1 CD19 CAR-T细胞结构示意图
CD19 CAR 作为CD19 CAR-T细胞的核心部件，其表达情况决定了CD19 CAR-T细胞制备的成败。文章中MacLeod et al.就是通过检测CD19 CAR的表达来评估基因编辑同种异体CD19 CAR-T细胞制备成功率。
接下来，我们就来看一看文章中是如何利用流式细胞术检测CD19 CAR的表达的。
流式细胞仪：BD Fortessa flow cytometer (BD Biosciences)
主要试剂：生物素标记的CD19-Fc蛋白 (Cat.# CD9-H8259) 购自ACROBiosystems公司，PE标记的链霉亲和素（Streptavidin-PE）和anti-CD3-BV711抗体购自BioLegend公司。
检测样品：Mock nucleofected T细胞组 和TRC1-2 nucleofected T细胞组
检测原理：生物素-亲和素系统、抗原-抗体系统和流式细胞分析技术相结合（见图2）。
图2 流式细胞术检测T细胞表面CD3分子和CD19 CAR表达的原理示意图
检测简要流程：
第一步：利用CD19 CAR能特异性结合CD19蛋白的特性，如果待检T细胞正常表达了CD19 CAR，生物素标记的CD19-Fc蛋白就能被标记到待检T细胞表面；
第二步：利用生物素能特异性结合亲和素（Streptavidin-PE）和Anti-CD3--BV711抗体能特异性结合CD3分子的特性，如果待检T细胞表面有生物素和CD3分子，链霉亲和素上的PE和Anti-CD3抗体上的BV711荧光标记就能被标记到待检T细胞表面；
第三步：制备好的单细胞悬液上机进行流式细胞分析。
检测结果：利用流式细胞术对两组待检T细胞表面CD3分子和CD19 CAR表达情况的检测结果显示，CD3阴性T细胞群中CD19 CAR表达的比例要高于CD3阳性T细胞群。
图3 流式细胞术检测CD19 CAR-T细胞表面CD3分子和CD19 CAR表达情况
流式细胞术作为一种在功能水平上对单细胞进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好等诸多优势，而生物素-亲和素系统的高亲和力牢固结合和多级放大效应，在与流式细胞术结合使用时，使得细胞定量分析更加灵敏简便。
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参考文献：
[1] MacLeod et al., Integration of a CD19 CAR into the TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR T Cells, Molecular Therapy (2017), http://dx.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.02.005
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