利用基于 HTRF 的 Tag-lite 技术检测胰高血糖 素 GLP-1 受体的 Kd 值

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2021/2/4
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    Cisbio 的 Tag-lite HTRF 平台能 够 有效 地 用 HTRF 荧 光
    团标记目标位点上感兴趣的蛋白。细胞表面受体可以插
    入 SNAP-tag 质粒中,然后用这种结构转染细胞并表达
    标记的受体。通过添加 snap -lumi4-Tb 底物,用铽 (Tb)
    穴状化合物标记受体。为了进行结合试验,受体的配体
    用 HTRF 受体荧光团标记,例如 d2。当 d2 配体与铽标
    记的受体结合时,可以使用具备 HTRF 功能的微孔板读
    板机检测受体到配体的时间分辨荧光共振能量转移 (TRFRET) ( 图 1)。
    Cisbio 提供了多种标签和兴趣蛋白标记编码的质粒,以
    及已经用这些结构物转染的冷冻细胞。该结构体能够表
    达标记蛋白,如受体,可以用铽标记,同时其受体配体
    ( 激动剂或拮抗剂 ) 用受体荧光团标记。Tag-lite 平台适
    用于广泛的应用,如受体二聚化、配体结合分析和第二信
    使评估。结合动力学可以研究药物 - 蛋白质复合物的结
    合和解离速率,是优化候选药物体内疗效的必要步骤
    1
    优势
    • 提供可靠的,免洗的饱和结合实验
    • Cisbio HTRF 平台提供多种配置实验和试剂的选项
    • 已有经过认证的 HTRF 仪器,确保仪器性能
    APPLICATION NOTE
    利用基于 HTRF 的 Tag-lite 技术检测胰高血糖
    素 GLP-1 受体的 Kd 值
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    胰高血糖素样肽 -1 受体 (GLP1R) 在胰腺细胞中表达,其
    激活刺激腺苷酸环化酶途径,导致胰岛素合成和释放增
    加。因此,GLP1R 被认为是治疗糖尿病的一个潜在靶点
    2
    GLP1R 也在大脑中表达,它参与控制食欲,并在记忆和
    学习机制中具有潜在的重要作用。
    在 这 里, 我 们 展 示 了 如 何 使 用 SpectraMax®i3x 和
    SpectraMax®iD5 多功能微孔 板读板机使 用 HTRF 进 行
    可靠的、免洗饱和结合分析。使用 Tag-lite 技术在 HTRF
    认证的 SpectraMax i3x 和 iD5 读板机上评估 GLP1R 配
    体的结合。
    饱和结合实验
    配体结合实验是评估特定配体与受体亲和力的重要手段,
    也是理解受体和配体相互作用机制的关键。结合研究因
    此成为药物发现过程的一部分,有助于设计出高选择性
    和特异性结合靶标药物。结合活性决定了单个生物分子
    之间的结合作用,如受体及其配体 ( 如激动剂 )。它通常
    用饱和分析来检测,用平衡解离常数 (Kd) 来表示。Kd
    用于评估配体与其靶标之间的相互作用强度并对其作用
    强弱程度进行排序。Kd 值越小,配体与靶标的结合亲和
    力越大。在竞争或抑制研究中,选择合适的配体浓度是
    准确测定 IC
    50 和抑制常数 (Ki) 的必要条件。一般来说,
    浓度达到或略低于 Kd 值是可以接受的。使用高于 Kd 值
    的配体浓度会使药物看起来不如它们在体内的效力。
    饱和结合试验检测总结合和非特异性结合浓度增加的配
    体 ( 图 2 )。荧光配体滴定到含有固定数量标记细胞的溶
    液中,孵育至平衡。当荧光配体与受体结合时,TR-FRET
    发生,并通过 HTRF 认证的微孔板读板机进行检测。得
    到的 HTRF 比率代表总结合。非特异性结合方式作为阴
    性对照,其使用未标记的配体进行检测,说明已标记的
    配体与受体、非受体分子或微板的非特异性结合
    2
    检测时,将荧光标记的配体滴定到含有固定数量标记细
    胞和 100 倍摩尔浓度的未标记配体的溶液中。标记的和
    未标记的配体竞争与标记的 GPCR 结合。由于非特异性
    配体过多,它会与受体结合,所以不会发生 TR-FRET。从
    这种滴定法得到的 HTRF 比率代表非特异性结合。通过
    从每个荧光标记配体浓度的总结合减去非特异性结合来
    计算特异性结合。
    图 1 Tag-lite 细胞表面结合实验示例。GPCR 兴趣基因序列插入到 SNAP-tag 质粒中,然后细胞转染并表达该受体,GPCR 通过添加
    snap -lumi4-Tb 底物共价标记一个穴状化合物供体。最后结合实验使用标记配体实现。
    2 4
    Tag-light
    SNAP-tag
    plasmid
    GPCR-expressing
    Tag-light cell
    Pre-labeled
    Tag-light cell
    1 3 5
    Tag-light
    CGCR
    plasmid
    Transfection
    GPCR labeling with
    SNAP-Lumi4-TB substrate
    Binding
    assay
    Labeled-ligand
    displacement
    with competing
    compound
    N N H
    NH
    N
    2
    N
    O
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    材料:
    • Tag-lite GLP1R 表达,Tb 标记的冷冻细胞 (Cisbio cat.
    #C1TT1GLP1)
    • Tag-lite 缓冲液 (Cisbio cat. #LABMED)
    • GLP1 受体红色激动剂 (Cisbio cat. #L0030red)
    • 毒晰外泌肽 4
    (Exendin 4,Sigma-Aldrich cat.# 1269105)
    • 白色,低体积 384 孔微孔板 (Greiner cat. #784075)
    • 带 有 HTRF 检 测 卡 盒 (Molecular Devices cat. #0200-
    7011) 的 SpectraMax i3x 多功能微孔板读板机 (Molecular Devices cat. #i3x)
    • 带 有 HTRF 检 测 系 统 (Molecular Devices cat. #6590-
    0144, 包含增强型 TRF 模块及 HTRF 滤光片 )
    方法
    细胞
    根据产品说明准备细胞,冷冻的细胞在 37℃ 解冻,转移
    到含有 5 ml 1x Tag-lite 缓冲液 (TLB) 的试管中。4℃,
    1200g,离心 5 min。吸出上清液,重悬于 2.7 ml 的 1x
    TLB 中。
    荧光标记配体
    GLP1 受体红色激动剂是一种用红色荧光 HTRF 探针标记
    的 Exendin 4 衍生物。将原浆浓度稀释于 1X TLB 中制备
    400 nM 浓度的红色激动剂 ( 原浆浓度见试剂盒说明书 )。
    10 个额外的 1:2 稀释,然后用 1X TLB 得到最终浓度从
    100 nM 到 0.097 nM。
    非标记配体
    稀 释 原 溶 液 到 1 x TLB ( 见 产品说 明 ) 制 备 40μM 终浓
    度无标记 Exendin 4 配体。这相当于最大标记配体浓度
    400 nM 的 100 倍摩尔。
    Total binding measurement
    Non-specific binding measurement
    图 2 Tag-lite 饱和结合实验。总结和检测通过荧光配体与受体的结合出现的 TR-FRET 测定。非特异性结合检测是通过过量的非标记
    的配体与荧光标记的配体竞争结合标记的 GPCR,未标记的配体结合至受体上 TR-FRET 不会发生。
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    实验板设置
    按照 Cisbio 配体结合说明书将试剂分配到板内 ( 图 3 )。
    384 孔白板孔内注入 10 μL GLP1 受体细胞,5 μL TLB 添
    加至总结和孔内,5 μL 未标记配体添加至非特异性结合
    图 3 384 孔低体积微孔板实验设置。实验板在室温孵育 2 h 后,在 SpectraMax i3x 和 iD5 读板机上检测 TR-FRET ( 见表 1 的仪器设
    置 )
    表 1 i3x 和 iD5 的仪器设置
    4
    lls
    μL
    Total binding
    � μL
    Non-specific binding
    Unlabeled ligand
    � μL
    Fluorescent
    ligand
    (titration)
    � μL
    Read on an HTRF
    compatible reader
    1 3
    Incubate
    �h at RT
    2 2
    1X
    SpectraMax i3x reader SpectraMax iD5 reader
    Additional components required HTRF Detection Cartridge: P/N 0200-7011 HTRF Detection System: P/N 6590-0144
    Excitation 340 nm / 80 nm 340 nm / 70 nm
    Emission Donor filter: 620 nm
    Acceptor filter: 665 nm
    Donor filter: 616/10 nm
    Acceptor filter: 665/10 nm
    Number of flashes 30 30
    Integration delay 30 μs 20 μs
    Integration time 400 μs 200 μs
    Other settings Read height is easily optimized for different volumes and plate formats
    孔中。最终,5 μL GLP1 受体激动剂 exendin 4- 红色标
    记物添加到所有孔中。将实验板在室温孵育 2 h 并用优化
    的仪器设置 ( 表 1 ) 在 SpectraMax i3x 和 iD5 读板机上
    读取。两个读板机都进行高度优化以确保最佳的实验灵
    敏度和动态范围。
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    数据分析
    HTRF 分析涉及 Cisbio 的专利比率法,该方法基于检测
    到的两个发射波长。616 nm 处的供体发射光被用作内
    参,而 665 nm 处的受体发射光被用作测定生物反应 ( 结
    合 ) 的指示剂。这种比率测量 ( 受体与供体荧光的比率 )
    减少了孔间的变异,并消除了化合物干扰。在下面的步骤
    4 中计算的 Delta F,将信号去除背景,对于测定之间的
    比较是有用的。根据 665 nm / 616 nm 的比值计算结果,
    用 Delta F 表示如下 :
    1. Ratio = x 10
    4
    Emission665nm
    Emission616nm
    2. Mean Ratio = ∑ratios
    2
    3. CV = x 100
    Std deviation
    Mean ratio
    4. Delta F = Standard or sample Ratio‒Rationeg x 100
    Rationeg
    (Rationeg = Ratio of negative control)
    数据通过 SoftMax® Pro 软件获取并分析,软件内已预置
    了 HTRF 的模板可以简要的检测和分析。
    GLP-1 receptor agonist (nM)
    Ratio
    Parameter
    Kd
    (nM)
    Cisbio’ s predefined value
    5
    SpectraMax i3x reader
    0.816
    SpectraMax iD5 reader
    2.347
    图 4 在 SpectraMax iD5 读板机上检测饱和结合曲线。饱和结合实验对增加的配体浓度达到平衡时检测总结和与非特异。特异性结合
    的比率 ( 蓝色曲线 ) 为总结合率 ( 红色曲线 ) 减去各浓度下非特异性结合率 ( 绿色曲线 ) 的比值。
    表 2 Tag-lite 结合饱和曲线的结果总结
    结果
    对总结合孔 和非特异性结合孔的每个标记配体浓度计
    算 HTRF 比率。通过从每个荧光配体浓度下的总结合减
    去非特异性结合计算特异性结合。如上文所述,对数据
    进 行 分析,并 使 用 SoftMax Pro 软 件进 行 双 直 角双 曲
    线拟合 ( 图 4 ),得出最佳结果,读数设置如表 1 所示。
    SpectraMax i3x 读板机产生的饱和曲线 ( 这里没有显示 )
    与 SpectraMax iD5 读板机类似。在特定饱和曲线中双直
    角双曲线拟合中拟合参数 B 为 Kd。Cisbio 建立了一个 5
    nM 或更低的 Kd 值,以确认酶标仪能够成功地测量带有
    红色受体的 Tag-lite 分析。SpectraMax i3x 读板机的 kd
    值为 0.816 nM, SpectraMax iD5 读板机的 kd 值为 2.347
    nM ( 表 2 ),证实了这两种仪器检测这些 Tag-lite 实验的
    能力。