布鲁氏菌病诊断的新方法 —荧光偏振技术

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2021/2/4
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    热点事件回顾
    2019 年 11 月 28-29 日,中国农业科学院兰州兽医研究
    所口蹄疫防控技术团队先后报告有 4 名学生布鲁氏菌病
    血清学阳性
    [1]。随着检测范围的扩大,截至 2020 年 11
    月 30 日,当地累计检测 79357 人次,重复检测 10786 人
    次,实际检测 68571 人,经省疾控中心复核确认,抗体
    阳性人员 10528 人
    [2]
    经专家组调查,2019 年 7 月至 8 月,中牧兰州生物药厂
    在兽用布鲁氏菌疫苗生产过程中使用过期消毒剂,致使
    生产发酵罐废气排放灭菌不彻底,携带含菌发酵液的废
    气形成含菌气溶胶,扩散后导致人体产生抗体阳性
    [3]
    布鲁氏菌病简介
    布鲁氏菌病 ( 简称布病 ) 是由布鲁氏菌引起的一种变态反
    应性人畜共患传染病,其主要感染牛、羊、猪、犬、鹿等
    哺乳动物。在我国大部分地区羊是主要感染源,其次是
    牛和猪。布鲁氏菌可以通过破损的皮肤、黏膜、消化道
    和呼吸道等途径传播。染疫的家畜是人间布病的主要传
    染源,人由于接触患病的牲畜及其产品或其污染物而感
    染布病。布病主要损害人、畜的生殖系统和关节,对畜牧
    业的发展以及人类健康产生了较大的危害。目前布病是
    《 中华人民共和国传染病防治法 》规定的 35 种传染病
    中的乙类传染病,并被列为二类传染病。
    布鲁氏菌病现行诊断方法及比较
    由于布病的发生、发展和转归比较复杂,其临床表现多
    种多样,很难以某一种症状来确定诊断。对布病的诊断,
    需要结合患畜或病人的流行病学史、临床症状和实验室
    检查等情况来综合诊断。及时、准确地诊断布病是控制
    和根除布鲁氏菌病的关键。现如今,我国对于动物和人
    类布病的实验室诊断方法大体分为两类:一类是以检测
    布鲁氏菌抗原免疫反应为主的血清学诊断,另一类是证
    明病原体存在的病原学诊断,具体的诊断方法见下面表格
    1 和表格 2。
    TECHNICAL NOTE
    布鲁氏菌病诊断的新方法
    —荧光偏振技术
    表格1 动物布病实验室诊断方法[4]
    初筛试验 确诊试验
    血清学诊断虎红平板凝集试验(RBT)(GB/T 18646)
    全乳环状试验(MRT)(GB/T 18646)
    间接酶联免疫吸附试验(ELISA)
    荧光偏振试验(FPA)*
    试管凝集试验(SAT)(GB/T 18646)
    补体结合试验(CFT)(GB/T 18646)
    竞争酶联免疫吸附试验(ELISA)
    病原学诊断 显微镜检查
    细菌分离培养
    PCR
    细菌鉴定
    *农业部国家卫生计生委发布的《国家布鲁氏菌病防治计划(2016-2020年)》中将FPA列为初筛试验
    表格2 人类布病实验室诊断方法[5]
    初筛试验 确诊试验
    血清学诊断虎红平板凝集试验 (RBT)
    胶体金免疫层析试验 (GICA)
    酶联免疫吸附试验 (ELISA)
    试管凝集试验 (SAT)
    补体结合试验 (CFT)
    抗人免疫球蛋白试验 (Coomb′ s)
    病原学诊断 布鲁氏菌培养物涂片革兰染色检出疑似布
    鲁氏菌
    从病人血液、骨髓、其他体液及排泄物等任一病理材料
    培养物中分离到布鲁氏菌
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    诊断布鲁氏菌病的“ 金标准 ”普遍认为是分离和鉴定病
    原,而布鲁氏菌在体外生长非常缓慢,一般需要培养几天
    甚至数周才能出结果,并且该试验需要在生物安全三级
    实验室,由经验丰富的技术人员来完成,所以该试验不
    适合现场的即时诊断或者疫情需要控制时的快速诊断。
    PCR 方法因其具有速度快、灵敏度高和安全等优点,越
    来越多的被应用于人类和动物的感染诊断,但是布鲁氏
    菌 PCR 检测在不同实验室之间表现不一致,对样品制
    备程序、基因组靶标的选择、检测技术等重要技术方面
    还没有形成标准化
    [6]。与培养法和 PCR 法相比,从技术
    角度来看,血清学诊断方法比较经济和相对简单,更适
    合进行大规模的筛查和诊断,特别是在流行地区。传统
    的血清学诊断方法也有各自的优缺点,如试管凝集试验
    (SAT)、补体结合试验 (CFT) 等耗时较长、方法繁琐且判
    断较为困难,结果判定非常依赖于技术人员的经验;虎
    红平板凝集试验 (RBT) 虽然操作简单,几分钟内就能得
    到结果,但它的高灵敏度对接种疫苗的动物会产生假阳
    [7],在交叉反应细菌感染的患者中也会产生假阳性反
    [7];酶联免疫吸附试验 (ELISA) 虽然具有较高的特异性
    和敏感性,但试验过程需要多次洗涤和孵育,对操作人
    员专业要求高且步骤耗时较长。虽然这些不足在很大程
    度上可以通过联合使用多个血清学试验来克服,但人们
    一直在寻求一种快速、简便、经济且更准确的布鲁氏菌病
    检测方法。
    新兴的布病检测方法——荧光偏振试验
    (FPA)
    1. 荧光偏振试验 (FPA) 的原理
    荧光偏振试验 (FPA) 是一种抗原 / 抗体相互作用的简单
    技术,该试验基于物理原理:在溶液中,分子的旋转的
    速度与其质量有关。小分子的自旋速度较快,从而使光
    快速去极化,测得的偏振值较低,而大分子的旋转速度
    较慢,因此对光的去极化更少,测得的偏振值较高。FPA
    以毫偏振单位 (mP) 来衡量去极化的程度。在测试期间,
    将血清样品与被荧光染料标记的抗原小分子孵育,在布
    鲁氏菌属的抗体的存在下,形成了大的荧光复合物。在阴
    性样品中,抗原是未结合的状态,与布鲁氏菌属阳性样
    本相比,这些较小的抗原分子旋转得更快,因此引起光
    的更大去极化。
    荧光偏振技术原理
    2. 荧光偏振试验 (FPA) 的工作流程
    该试验操作很简便,将试剂盒提供的阳性对照、阴性对
    照及待检血清加入到 96 孔纯黑色微孔板中,再加入样品
    稀释液对各样品进行稀释,接着在 MD 荧光偏振仪上读
    取对照品和样品的空白值,之后加入示踪剂 ( 荧光染料
    标记的抗原 ) 并混合孵育,然后再次在 MD 荧光偏振仪
    上读取试验值。在 MD 荧光偏振仪的 SoftMax Pro 软件
    里,空白值和试验值均包括垂直和水平两个方向上的偏振
    光强度,应用试验值减去空白值之后的 Delta FP 值来计
    算毫偏值 (mP),mP 值的计算公式如下:mP = [(S - P*G)/
    (S + P*G)]*1000,其中 S 是水平方向上的 Delta FP 值,P
    是垂直方向上的 Delta FP 值,G 是荧光测量路径的校正
    因子,在 SMP 软件中 G 因子可以通过计算或者手动方式
    来进行调节
    [9]。最后用样品的 mP 值减去阴性对照平均
    mP 值得到的 Delta mP 值,再根据试剂盒给出的截断
    值进行结果判定。上述的测试程序、数据分析和结果判
    定都能够在强大的 SoftMax Pro 软件中完成,并能够生
    成、打印和导出 PDF 格式的试验报告,而且报告格式支
    持个性化定制。
    目前,国内已有动物布鲁氏菌病荧光偏振抗体检测试剂
    盒,进口试剂盒选择种类较多,包括动物和人的布鲁氏
    菌病荧光偏振抗体检测试剂盒。
    3. 荧光偏振试验 (FPA) 的特点
    荧光偏振试验 (FPA) 作为新兴的布鲁氏菌病检测方法,
    事实上它在人类医学中已经使用了很多年
    [7]。世界动物卫
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    程序设置 结果判定
    生组织 (OIE) 在 2016 年批准了 FPA 法用于牛布病的验证
    诊断以及羊和猪布病的检测
    [8],并且欧盟和美国农业部
    也批准 FPA 法用于各国进出口贸易时牛群的检测。在我
    国,荧光偏振试验 (FPA) 也在现行的《 国家布鲁氏菌病
    防治计划 (2016-2020 年 )》中被列为动物布病的初筛试
    验。
    它是一种均相检测方法,整个试验都在溶液中进行,没
    有分离和洗涤步骤,因此非常快速,可以在实验室或现场
    进行。与前述的传统血清学诊断方法相比,荧光偏振试
    验 (FPA) 操作简便,能够快速给出结果 ( 几分钟内 ),在
    实验室和仪器之间具有高度的可重复性。整个测试都是
    在荧光偏振仪上进行,试验结果很客观,减少了凝集试
    验结果判读时易发生的人为错误和可变性。此外,传统
    血清学检测方法的抗原大都是布鲁氏菌细胞膜上的光滑
    脂多糖 (S-LPS),而 FPA 的抗原分子使用的是光滑脂多
    糖 (S-LPS) 中最具有免疫原性优势的 O- 多糖 (OPS),这
    使得 FPA 法能够区分免疫动物和自然感染动物,疫苗免
    疫后动物体内残留的抗体滴度能够被检出,抗体水平非
    常低,而自然感染动物体内抗体水平高。基于以上优点,
    荧光偏振试验 (FPA) 很适合大规模布鲁氏菌病的筛查和
    检测,值得推广