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基因组DNA Southern杂交

来源:本站原创  2006/3/24 14:27:00   访问量:10321
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基因组DNA Southern杂交

1)基因组DNA Southern印迹的制备

预备

1.用适当的限制性内切酶消化基因组DNA样品(10μg)。

2.进行琼脂糖凝胶电泳。一般用0.71.0%的琼脂糖凝胶分离基因组DNA,它在115kb的范围内有较好的分辨率,可选用TBETAE缓冲液。琼脂糖凝胶电泳需在1V/cm的电压下进行,如果要分离片段大小相似的DNA带,应用较大的凝胶(20×25cm)。常用的标准品是由Hind Ⅲ消化的λDNAHae Ⅲ消化的ΦX174 DNA1001000bp的梯形图谱。电泳完毕,将凝胶放在紫外透射仪上,并在凝胶旁放一尺子进行拍照。当把凝胶从盘内移动紫外透射仪时,小心不要将凝胶滑落或弄破。

 

Southern印迹的制备

1.将凝胶转移至塑料盒内。

2.加入至少4倍凝胶体积的0.25mol/L HCl使DNA脱嘌呤,置室温摇床温育15min。这时凝胶上样缓冲液中的溴酚蓝应变黄色,如果15min后仍呈蓝色,应再温育5min

3.小心地塑料盒内HCl弃去,用蒸馏水漂洗凝胶一次。

4.加入至少4倍体积的变性缓冲液,置室温摇床温育20min

5.用新鲜缓冲液重复步骤4,小心弃去变性缓冲液,用蒸馏水稍加漂洗。

6.加入至少4倍体积的中和反应缓冲液,置室温摇床温育15min

7.用新鲜缓冲液重复步骤6

8.当处理凝胶时,裁一张略大于凝胶的滤膜(硝酸纤维膜或尼龙膜),预先用蒸馏水将滤膜浸湿后用20×SSC浸泡至少15min

9.安装转移装置。在盘中加入印迹缓冲液(20×SSC),在缓冲液面作一平台,比如可倒置一凝胶盘,上面盖三张经20×SSC饱和过的滤纸(Whatman 3MM),平台两侧的滤纸应浸泡在缓冲液中,用10ml的玻璃吸管在其表面小心滚动以赶出所有气泡,并将滤纸推平。

10.  倒数毫升20×SSC于滤纸表面,将凝胶面向下倒扣在滤纸上,小心赶出凝胶与滤纸间的气泡,凝胶四周用胶布或塑料薄膜包裹以防缓冲液从凝胶周围直接流至纸中(虹吸短路)。

11.  加数ml 20×SSC浸没凝胶,表面覆以滤膜,确保凝胶与滤膜之间无气泡。

12.  裁三张大小合适的3MM滤纸,用20×SSC浸湿后铺在滤膜表面。

13.  放一叠干燥的吸水纸(印迹纸或纸巾)在3MM滤纸上(约58cm高)。

14.  置一玻璃板于吸水纸上,其上放一重约0.751kg的物体。

15.  DNA转移可进行1216h(如过夜),确保槽内有足够的20×SSC13L)。

16.  毛细管虹吸转移完毕,小心拆卸印迹装置。将膜与凝胶一起转移至干燥的滤纸上,凝胶在上,用软铅笔标记凝胶和滤膜的加样孔位置,撕去凝胶。

17.  5×SSC漂洗杂交膜以去除琼脂糖残迹。

18.  将滤膜放在一张干燥的3MM滤纸上稍微晾干。

19.  固定DNA于滤膜上,若用硝酸纤维素膜,在80℃真空箱中烤2h;若用尼龙膜,将DNA面朝下暴露于紫外透射仪35min

20.  这时的滤膜已可用于杂交,或贮存在4℃。硝酸纤维素膜需真空保存,尼龙膜需用塑料薄膜密封。

 

2DNA印迹杂交

1.5×SSPE浸渗DNA滤膜。

2.将浸湿的DNA滤膜放入塑料袋内,袋的四边密封并剪去一角。

3.从缺口处加入预杂交液(0.1ml/cm2),避免加入气泡,将袋中的气泡全部挤出,封口。

4.将塑料袋置水浴摇床中温育,或夹在两块玻璃板中置65℃烤箱24小时,确保滤膜表面无气泡。

5.95 10min使探针变性,立即置冰浴冷却5min

6.剪去杂交袋的一角,将预杂交液倒入1550mlFalcon试管中,将约1020ng/ml(随机引物标记的)或50100ng/ml(缺口平移法的)探针加到预杂交液或新鲜配制的杂交缓冲液中(如果打算用硫酸葡聚糖)。一般来说,106107cpm/ml已足够,轻轻混匀,用一次性的塑料移液管将杂交液加到塑料袋内的滤膜上。

7.从开角处将杂交液袋内的气泡全部挤出,用纸巾吸去流出的少许杂交液,小心封口以防杂交液漏出。必要的话,可将此杂交袋套在另一塑料袋中以防放射性污染。

8.65℃水浴摇床中温育或夹在两块玻璃板中置烤箱烘烤1216h

9.杂交后,剪去杂交袋的一角,挤出杂交混合液倒入1550mlFalcon管中,小心不要使放射性溶液溅出。

10.  将杂交袋完全打开,用钝头镊子将滤膜转移至盘内以便漂洗,立即用缓冲液12×SSC0.1SDS)洗滤膜。

11.  室温下,用漂洗缓冲液1漂洗滤膜三次,每次5min

12.  室温下,用漂洗缓冲液20.25×SSC0.1SDS)漂洗滤膜两次,每次5min

13.  65℃用预热的漂洗缓冲液2洗膜13次,每次15min。在更换缓冲液之间,应用盖革计数器检测滞留在印迹中心的放射性(将印迹中心所期望的特异性信号与印迹边缘所期望的本底信号相比较)。

14.  充分漂洗后,将滤膜放在一张3MM的滤纸上稍微晾干,将潮湿的滤膜封在薄塑料袋内或用塑料薄膜包裹。

15.  滤膜的放射自显影:将印迹膜(封在塑料袋内,DNA面朝上)放在X射线暗盒底部,其上放置(摄影的)胶片,增感屏常规贴在盒盖内面,关闭暗盒,在-70℃进行放射自显影过夜~两周。

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