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Southern Blots 技术

来源:生物谷  2007/6/25 21:40:00   访问量:6793
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Southern Blot Flow
一 基因组酶切和电泳
在200 μl 微量离心管中加入:
25 μl DNA样品(约10μg),
3μl 限制性内切酶(MBI,10 U/ μl)
5 μl 相应的10×buffer,
补水到50μl。
然后加一滴矿物油覆盖, 稍微离心后放于37℃水浴8-12小时。酶切完后,取5μl 酶切DNA样品于0.8%的琼脂糖凝胶上检测酶是否充分。如果酶切充分,灌制0.8%的agrose胶,加入上样buffer后,在25—30V稳压电泳12—16hrs。
注意:在southern杂交中对,DNA的质量要求较高,否则酶切不完全导致失败。
二 转膜
1 用0.2MHCl 脱嘌呤处理,偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全变成黄色,大约需要15~30分钟。然后用水漂洗凝胶2~3次,将水倒尽,加入碱变性液,偶尔轻轻振荡至溴酚蓝完全恢复到原来的蓝色(大约需要20~30分钟)。
注意:此方法对酶切后目标片段大于15kb时用,如果小于15kb最好不要进行脱嘌呤处理,否则容易将片段打断,导致转膜后结合不紧密。
2 取一磁盘架上一洗净玻璃板,在磁盘中倒入适量的转膜缓冲液,在玻璃板上架两层长滤纸(30cm左右)(注意不要产生气泡)搭成盐桥。(滤纸比胶弱宽)依胶大小裁好尼龙膜,写好标记,正面向下,紧贴于胶上,防止有气泡产生,接这压两张同样大小的滤纸,不可过大以免短路,胶周围用X光片压条。胶应反面朝上因为DNA多在胶的底层。堆积吸水纸。上面放一小玻板,板上加一500 g左右的重物。
注意:防止短路
3 转膜16---20hrs后,将尼龙膜取下,胶染色,观察转膜效果。将膜用2xSSC浸泡20分钟,滤纸吸干后放在烘箱中烘2hrs(80℃)。待用。
三 杂交
¨  杂交炉与杂交管预热至65℃
¨  尼龙膜用2×SSC浸泡
配置杂交液
ssDNA沸水变性10min,冰浴10min,置冰浴备用
Components   Volume (ml)   Note
ddH2O   20.7   
50×Denhardts 0.6  
P/H stock   8.1  
20% SDS (OR 10% SDS)  0.3 (OR 0.6)  
Total 30 ml for 2 blots. 65℃预热.

Add prepared ssDNA (10mg/L) ≥0.3 ml
倒入杂交液,加入尼龙膜,65℃预杂交4~5小时(新膜)
注意:赶尽膜与膜之间的气泡后把几张膜同时放入杂交管,并用玻棒赶尽膜与管壁之间的气泡,最后加入杂交液,盖好管盖。
四 探针标记
(for1~2 blots)
ddH2O  7 ml
Marker  1.5 ml
模板DNA  2 ml (about 100 ng)
沸水变性8min,冰浴10min,瞬时离心
Add Buffer+Primer 7.5 ml
Add dNTPs(-dCTP) 3 ml
Add Klenow (about 1.5U) 1 ml (2U/ml)
瞬时离心
Add 32p-dCTP 1~2 ml (10~20 uCi per blot)
37℃ 水浴≥4小时
五 杂交
向标记探针的离心管中
Add 等体积TE 25 ml
Add 10×体积变性剂(杂交液) 250 ml
沸水变性10min,冰浴10min,将变性好的探针加入到杂交液中,混匀,65℃杂交过夜(12~16小时)。
六 洗膜
1. 2×SSC,0.5%SDS 5min
2. 0.1×SSC,0.1%SDS xmin (RT)
3. 0.1×SSC,0.1%SDS χmin (65℃)
(洗膜过程中不断检测放射性强度直至200~500)
滤纸吸干洗液,保鲜膜包好,暗室中压片,根据放射性强度暴光若干天。
冲洗X光片。

说明:
由于做southern的整个过程比较复杂涉及到的试剂也比较多,我这里仅做了个简要的叙述,但基本的实验过程已列举出来了,此过程中的试剂可以根据具体的实验要求适当调整,如果各位有那里不清楚或者那些部分需要具体的介绍,请与我联系,我们共同讨论学习,另外,做杂交的过程中一定要注意防止同位素泄漏,做好个人的防护工作。

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