Nature Methods:刊发全新的circRNA的下调方法

来源: 上海吉凯基因医学科技股份有限公司   2021-2-26   访问量:1272评论(0)

上个月初,吉凯针对circRNA的研究作了一场直播讲座。当时小陈老师总结了下调circRNA的方法,分别是shRNA、Crispr-Cas9和ASO,详情大家可以点击此处去B站查看。


但是,我们必须承认,这几种方法下调circRNA方法都有一定的局限性。第一种,shRNA的方法靶点设计范围小,一旦无效很难进一步设计靶点,可能脱靶到亲本线性RNA。第二种,CRISPR-Cas9系统如果敲除circRNA所在外显子很可能会影响亲本线性mRNA的功能;如果敲除circRNA两侧内含子序列,可能无法有效敲低circRNA,也有可能会影响亲本mRNA的表达水平;同时CRISPR-Cas9需要挑选单克隆,实验流程复杂。第三种,ASO面临表达时间短,部分细胞转染困难,难以用于体内实验等问题。


是否还有新的方法可以应用到circRNA的下调,且局限性更小呢?


2021年1月下旬发表在Nature methods的文章“Screening for functional circular RNAs using the CRISPR-Cas13 system”向我们介绍一种全新的circRNA的下调方法

研究背景

最近的很多研究已经发现,在哺乳动物细胞中,RNA 靶向的VI型CRISPR效应分子,包括Cas13a、Cas13b、Cas13d,能够在gRNA介导下切割靶向的单链RNA序列。VI型的CRISPR-Cas系统需要22nt-30nt的gRNA来介导有效的敲低;相比于RNAi有更高的特异性,对于和靶点RNA的错配,耐受度非常低。

实验方案

作者首先构建了不同物种的Cas13,然后分别在不同细胞设计同样的gRNA,比较敲低效率,甄选出敲低效率最高的Cas13蛋白。然后利用不同的gRNA设计方案,研究gRNA的位置、长度、单(双)碱基不匹配等,对于circRNA敲低效率的影响,并同时检测是否影响线性亲本mRNA的表达。


在验证了CRISPR-Cas13这个工具的有效性之后,作者利用这个系统设计一个cicRNA敲低文库,用来筛选可能影响细胞增殖的circRNA。

实验结果

首先,利用LwaCas13a、 PspCas13b、 PguCas13b、RanCas13b、 EsCas13d、 AdmCas13d、RfxCas13d这几个Cas13蛋白分别敲低KRAS和circPOLR2A、circRTN4这几个基因后,研究者发现RfxCas13d拥有更高的敲低效率。随后作者利用RfxCas13d去敲低另外八个circRNA,发现敲低效果都很明显,且不影响亲本线性mRNA的表达(图1)。

图1. CRISPR-RfxCas13d敲低不同circRNA


由于在CRISPR-Cas13发现之前,shRNA是下调circRNA的主要手段,因此作者比较了在多个circRNA上这两种敲低方法的效率。在9个不同的circRNA中,作者发现CRISPR-Cas13系统有着更高的敲低效率和更好的特异性,更少地脱靶到线性mRNA上(图2)。

图2. shRNA和CRISPR-Cas13敲低circRNA效果比较


进一步地,作者又研究了gRNA长度对于敲低效率的影响,在设计的一系列16-36nt的靶点中,作者发现当gRNA长度超过18nt时,靶点才逐渐发挥作用,当靶点长度达到22nt及以上时,敲低效果最高(图3)。

图3. 不同长度的gRNA对于敲低效率的影响


随后,通过在靶点的不同位置引入突变,研究其对敲低效率的影响,从而来验证CRISPR-Cas13系统的特异性。结果发现,gRNA对于-8~8位置出现错配更为敏感,会极大地影响敲低效率(图4)。

图4. gRNA序列错配对于敲低效果的影响


在完成了对于CRISPR-Cas13系统靶点设计特性的研究后,作者针对人源细胞中占据表达前10%的circRNA,利用Cas13系统定制一套敲低文库。分别在HT29、Hela、293FT细胞中筛选与增殖相关的circRNA。简要流程为,在表达RfxCas13d的HT29、Hela、293FT细胞稳定株中,以0.3的moi感染gRNA文库慢病毒;感染后持续培养30天,期间分别收取D1和D30的细胞,每组两个平行重复,提取基因组DNA测序gRNA的变化。最后作者筛选到,在HT29、Hela、293FT中,circFAM120A的敲除都将明显抑制细胞的增殖(图5)。后续通过研究,作者证明,circFAM120A通过抑制IGF2BP2和FAM120A结合,促进FAM120A翻译,从而促进细胞增殖。

图5. circFAM120A敲低抑制HT29、293FT、Hela细胞增殖


虽然CRISPR-Cas13已经被用于敲低RNA,但是其在circRNA领域的应用之前还没有被开发。本文通过大量的实验证明了CRISPR-Cas13用于circRNA敲低的特异性,基本不影响亲本mRNA的表达,通过点突变实验也证明了gRNA种子区严格互补对于circRNA有效敲低的重要性,这也表明了CRISPR-Cas13更低的脱靶的可能性。这项研究为我们后续研究circRNA的功能提供了一个重要的工具。


本文结果显示RfxCas13d拥有更高的circRNA敲低效率,其结果和Konermann在18年发表在Cell上的研究结果一致。因此,我们猜测RfxCas13d将来可能会成为RNA调控领域最重要的蛋白。并且,在Konermann的文章中,RfxCas13d融合NLS(CasRx,融合核定位序列的RfxCas13d)之后能够很好的定位在细胞核中,且能够有效敲低定位于细胞核内的LncRNA。我们有理由相信,通过NLS融合的RfxCas13d,可以有效敲低一些核定位的circRNA,而不必利用CRISPR-Cas9或者ASO。进一步地,考虑到RfxCas13d的更小分子量(~912aa),可以比较容易地包装进AAV病毒,将其应用到体内进行敲低实验也具有非常高的可行性。


需要注意的是,RNA靶向的Cas蛋白都被报道或多或少拥有部分反式切割的活性,因此其安全性和对细胞整体水平RNA的影响仍需要进一步评估。

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