Taq antibody封闭机制深度解读

来源: 翌圣生物科技(上海)有限公司   2021-2-4   访问量:1749评论(0)

Taq antibody封闭机制深度解读

常规PCR技术因能够快速扩增任何已知的DNA片段而被广泛应用于分子生物学的各个领域。但常规PCR技术容易出现引物二聚体或错配引起的非特异性扩增等现象,造成实验结果的不准确性。热启动PCR能够很好的解决上述问题,是最常用的提高PCR特异性的方法。Taq antibody是抗Taq DNA聚合酶(简称Taq酶)的抗体,可在低温时结合于Taq DNA聚合酶,封闭其聚合酶活性,防止错配或引物二聚体引起非特异性扩增;在PCR预变性95℃加热时,抗体蛋白变性,释放DNA聚合酶活性,完成扩增反应,达到热启动的效果。

1. Taq antibody高温快速失活,释放Taq DNA聚合酶活性

Taq antibody封闭热启动酶应用

热启动酶在热启动PCR的应用方面较为广泛,不仅有效防止非特异性PCR产物,而且在较难扩增的PCR反应如单拷贝基因的扩增、多重PCR和超长片段的扩增等应用尤为突出,大大改观了传统PCR技术的局限性。在病原微生物检测、遗传病诊断和法医鉴定等各个领域等实际应用中颇为广泛。在应对全球爆发的新冠疫情方面,热启动酶亦贡献颇多。

市面上常见的热启动酶,按热启动修饰方法主要分为化学法、配体法和抗体法等。但化学修饰物不能够批量合成,而且需要较长的激活时间DNA聚合酶才能释放酶活;配体修饰DNA聚合酶只在20-25℃效果较好,到40℃时,聚合酶的活性就被释放出来,即酶活封闭效果不稳定,特异性不好;而抗体修饰的热启动酶可以达到很好的封闭酶活的效果,即对应的封闭效果最佳,酶活释放速度快,因此应用最为广泛,目前市面上应用于SARS-Cov-2的一步法RT-qPCR检测试剂的核心酶基本都是抗体法热启动酶

Taq antibody作用机制解析

Taq antibody--减少非特异性扩增

以常用的Taq酶为例,Taq酶的聚合酶活性最适温度是72℃,但20℃-37℃下也具有一定聚合酶活性,在室温下配置反应体系或反应升温的时候,容易形成引物非特异性退火及引物二聚体,此时发生聚合反应,就会引起非特异性扩增。

我们用Taq AntibodyTaq酶的聚合酶活性暂时封闭,使其在低温时处于无活性状态,PCR预变性95℃加热时,Taq Antibody变性,解除封闭,Taq酶再现活性,就可以避免错配或引物二聚体引起非特异性扩增

Taq antibody--提高检测灵敏度

非特异性扩增的存在(可理解为“引物噪音”)是PCR反应的主要障碍,它会通过消耗引物和Taq酶显著降低目的基因扩增的灵敏度。

针对低丰度基因,抗体封闭一方面可以避免95℃预变性前的DNA聚合酶和模板的非特异性结合,提升PCR反应过程中DNA聚合酶的使用效率(使用效率可理解为与正确模板结合的效率另一方面抗体封闭后,95℃预变性DNA解链(释放出正确的引物退火位点),热启动形式增加了引物与微量的正确模板碰撞退火的效率,从而可保证低丰度基因有效检出

总之

抗体封闭热启动Taq酶可减少引物非特异性退火及引物二聚体的聚合反应的背景噪音信号,通过维持相对“纯净”的引物和模板等有效退火环境,有效提升灵敏度和扩增效率。

Taq antibody封闭Taq酶效果展示

我们做一个对比,看看Taq Antibody如何抑制非特异性扩增的。设置抗体封闭组(融合比例是1U Taq/0.1 μg Taq Antibody)和无抗体封闭组,将部分互补的引物对加qPCR反应体系中,37℃孵育40 min,分别检测产物荧光值,如表1。荧光值增高则表示发生了聚合反应。

1 Taq Antibody封闭效果

无抗体封闭

抗体封闭

荧光值

80000

24000

该抗体封闭组加入了翌圣生物的Taq酶单克隆抗体(Cat#31301ES),可以看到无抗体封闭组荧光值增高,表明Taq酶在37℃发生了聚合反应,而Taq酶单克隆抗体可以有效封闭聚合酶活性,由此可以抑制非特异性扩增。

我们将上述产物生成熔解曲线(图2),可以看到Taq酶单克隆抗体有效封闭聚合酶活性,产物片段大小与无聚合酶对照组一致,而无抗体封闭组明显发生了聚合反应。

2 Taq Antibody封闭效果熔解曲线

Taq antibody选择的认知局限

我们在选择热启动封闭抗体的时候,常常会步入以下误区:

误区一 热启动封闭抗体的好坏取决于抗体的亲和力

按照以往的认知,抗体有足够亲和力才能与DNA聚合酶结合,才能有效封闭。其实抗体结合于DNA聚合酶的活性封闭位点是有差异的,如果不能结合在有效阻断聚合酶活性的位点上,亲和力再高也是无用的。所以热启动封闭抗体结合位点非常重要,一个优质的热启动封闭抗体,应该能准确的结合活性封闭位点并阻断DNA聚合酶的聚合酶活性。

误区二 小鼠腹水生产的抗体性能稳定性不如大规模细胞悬浮生产

与人工操作的体外模拟生长环境的罐间悬浮生产不同,一方面腹水提供了天然的细胞生长环境,营养充足,有利于杂交瘤细胞的生长,通过控制相同遗传背景的小鼠数量即可保证生产的效率。在实际的热启动封闭抗体生产中,小鼠腹水生产非常稳定高产,月产40g不是难事。另一方面腹水属于天然免疫系统,抗体折叠修饰翻译更加天然,保证了抗体的结构性能。两种方式关键点均在于设置严苛的生产流程和质控标准

误区三 预变性时间越短越好

PCR反应中预变性步骤是为了打开DNA中的二级结构,使DNA充分变性;如果使用了热启动DNA聚合酶,预变性步骤可以解除封闭,释放DNA聚合酶活性。

但由于DNA模板如果长时间暴露在95℃pH<8.3的条件下容易造成脱嘌呤和断裂,DNA聚合酶长时间在高温下也可能活性降低,人们往往认为预变性时间越短越好。对此一是建议大家选择抗体封闭,因为相较于某些化学修饰法,抗体封闭的活性释放条件更温和,时间也更短;二是提醒大家,预变性不仅是为了解除封闭释放聚合酶活性,也为了使DNA充分变性,尤其对于复杂结构模板,充分的预变性必不可少。

如何获得高质量的Taq antibody

封闭抗体的品质和其它试剂原料一样,会影响检测产品的品质,所以对热启动封闭抗体的质量控制十分重要,不可或缺。下文以翌圣Hieff® Taq酶单克隆抗体为例,阐述如何获得高质量的Taq Antibody

1.成熟的放大生产工艺——翊圣Hieff® Taq酶单克隆抗体是翌圣生物自研自产的一款高品质热启动封闭抗体。小鼠腹水生产,月产量高达40g

2.高标准生产流程和专业的研发团队——翌圣Hieff® Taq酶单克隆抗体经历了高标准的生产流程,细微之处做到极致。包括生产环节中诸多要求,如在超净工作台区域进行防污染的佐剂致敏,筛选出高抗体表达量的杂交瘤细胞进行细胞扩大培养,高纯度标准,温和的纯化工艺等。通过严谨的蛋白晶体结构域预测与模拟找出聚合酶活性高效结合的封闭位点,并通过高通量抗体筛选和改造技术来获取酶活封闭效率100%Taq Antibody

3.严苛的质量控制——翌圣Hieff® Taq酶单克隆抗体的质量控制包括核酸外切酶残留、核酸内切酶残留、小鼠核酸残留、功能验证、封闭效率检测、批内稳定性、批间稳定性等。封闭效率的质控标准为95%,对标业内最高标准。

产品信息

产品名称

货号

规格

价格(元)

促销价(元)

Hieff® anti-Taq DNA Polymerase Antibody Taq酶单克隆抗体

31301ES60

100 ug

1153.00

229.00

31301ES80

1 mg

3653.00

1479.00

31301ES90

5 mg

14653.00

6159.00

31301ES92

10 mg

26353.00

11189.00

31301ES93

100 mg

231753.00

74599.00

31301ES94

1000 mg

1969552.00

499999.00

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关于翌圣

翌圣生物科技(上海)有限公司(Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.)成立于2014年,长期专注于分子酶原料及建库试剂盒等产品的研发和生产。我们的目标让下游企业节省更多的成本,为中国精准医疗的发展贡献自己的力量。翌圣生物拥有先进的分子酶双向技术平台、大规模蛋白发酵纯化技术平台、高效抗体筛选技术平台,目前已成功开发各类诊断分子酶、二代测序建库酶等40余种,并实现工业放大。翌圣生物开发的用于基因检测、体外诊断(IVD)相关酶原料获得了广大客户的认可。此外,我们还为工业客户提供定制化开发服务,以满足个性化需求。



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