Western及IP细胞裂解液(无抑制剂)使用说明

来源: 上海雅吉生物科技有限公司   2021-1-14   访问量:1850评论(0)

1.对于培养细胞样品:

a.融解Western及IP细胞裂解液(无抑制剂),混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM,或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。
b.对于贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)。按照6孔板每孔加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触动物细胞1-2秒后,细胞就会被裂解。植物细胞宜在冰上裂解2-10min。
对于悬浮细胞:离心收集细胞,轻轻vortex或者弹击管底以把细胞尽量分散开。按照6孔板每孔细胞加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。轻弹管底以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成50-100万细胞/管,然后再裂解。大团的细胞较难裂解充分,而少量的细胞由于裂解液容易和细胞充分接触,相对比较容易裂解充分。
对于细菌或酵母:对于1ml菌液或酵母液,离心去上清,如果有必要可以使用PBS洗涤一次,充分去除液体后,轻轻vortex或者弹击管底以把细菌或酵母尽量弹散。加入100-200微升裂解液,轻轻vortex或者弹击管底以混匀,冰上裂解2-10min。如果希望获得更好的裂解效果,细菌和酵母可以分别使用溶菌酶和破壁酶(Lyticase)消化,然后再使用本裂解液进行裂解。
裂解液用量说明:通常6孔板每孔细胞或者1ml的菌液或酵母液中的细菌和酵母量加入100微升裂解液已经足够,但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到150微升或200微升。每100万动物细胞用100微升本产品裂解后获得的上清,其蛋白浓度约为2-4mg/ml,不同细胞有所不同。
c.充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀、免疫共沉淀、酶或生物小分子检测等操作。
2.对于组织样品:
a.把组织剪切成细小的碎片。
b.融解Western及IP细胞裂解液(无抑制剂),混匀。取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM,或者根据实验需要加入适当的上述蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物。
c.按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液,如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量。)
d.用玻璃匀浆器匀浆,或使用生产的E6600 TissueMaster™手持式组织研磨仪研磨,直至充分裂解。也可以把组织样品冷冻后液氮研磨,研磨充分后加入裂解液进行裂解。
e.充分裂解后,10000-14000g离心3-5分钟,取上清,即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。每20mg冻存的小鼠肝脏组织用200微升本裂解液裂解后获得的上清,其蛋白浓度约为15-25mg/ml,不同状态的不同组织有所不同。
f.如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清,用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便,不必使用匀浆器或研磨设备,缺点是不如匀浆或研磨那样裂解比较充分。
附录:生产的各种裂解液主要特点、差异和选择
首先请参考下表,了解各种裂解液的主要特点和差异。

产品编号 P0013 P0013B P0013C P0013D P0013F P0013G P0013J P0013K
产品名称 Western及IP细胞裂解液 RIPA裂解液(强) RIPA裂解液(中) RIPA裂解液(弱) NP-40裂解液 SDS裂解液 Western及IP细胞裂解液(无抑制剂) RIPA裂解液(强,无抑制剂)
有效裂解成分 1% Triton X-100 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS 1% NP-40, 0.25% deoxycholate 1% NP-40 1% SDS 1% Triton X-100 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS
裂解强度 温和 温和 温和 温和
对膜蛋白的提取 一般 很好 较好 一般 一般 很好 一般 很好
对胞浆蛋白的提取 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好
对核蛋白的提取 较好 很好 较好 较好 较好 很好 较好 很好
胞浆磷酸化蛋白提取 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好
细胞核转录因子提取 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好
含蛋白酶抑制剂
含***酶抑制剂
不同物种样品兼容性
主要用途 WB, IP,co-IP WB, IP WB, IP WB, IP, co-IP WB, IP,co-IP WB, ChIP WB, IP,co-IP WB, IP



上海雅吉生物科技有限公司   商家主页

地址:上海市闵行区元江路5500号第1幢5658室
联系人:王源
电话:15301693058
传真:021-34661275
Email:yajikit@163.com